Eleocharis vivipara is an amphibious sedge that displays C4 traits under terrestrial environments and C3 traits in submerged environments. This plant is thus potentially advantageous for screening genes indispensable to the development of C4 photosynthesis. In this study, we performed de novo transcriptome analysis of E. vivipara using its terrestrial- and submerged-type plants. By next-generation sequencing (NGS), approximately 90 and 89 million reads were yielded for the terrestrial and submerged types, respectively, and were assembled into 27,249 unigenes. Of these de novo consensus sequences, 94.5% showed similarities to database-registered sequences, and 69.4% were assigned with Gene Ontology terms. Our de novo assembled sequence data should provide a foundation for genetic analysis of the C4 photosynthetic system.

バラ科シモツケ属のキイシモツケ（Spiraea nipponica Maxim. var. ogawae（ Nakai） Yamanaka）は、蛇紋岩地帯にて自生する和歌山県固有の植物である。県北部に位置する龍門山の山頂付近の群落は県の天然記念物に指定されている。キイシモツケは、かつては新種とされSpiraea ogawai Nakai と命名され登録されていた。しかし近年は形態学的比較に基づいて、高知県に自生するトサシモツケ（Spiraea nipponica Maxim. var. tosaensis（ Yatabe） Makino）と共に、近畿以北に自生するイワシモツケ（Spiraea nipponica Maxim.）の変種とされ、学名も上記のように改められている。本研究では、キイシモツケがトサシモツケおよびイワシモツケなどの近縁種とは顕著に異なるのかどうかを初めて分子系統分類学の立場から検討した。同時に、キイシモツケの蛇紋岩土壌との関わりについて若干の検討を行った。まず、3 種類それぞれに特徴的な葉の形態は、種子から同一の環境条件下で生育させても再現され、生来の形質であることがわかった。次に、龍門山の土壌の交換性金属イオンの元素組成を調べ、蛇紋岩土壌特有の組成をもつことが確かめられた。キイシモツケの植物体について、金属イオンの元素分析を行った結果、蛇紋岩土壌の元素の中で最も植物に対する毒性が強いとされるニッケル（Ni）が植物体内に取り込まれていることを認めた。さらにキイシモツケの種子は発芽時に3 者の中で最も強いNi 耐性を示し、若い苗では10 mmol L - 1 のNi 2 + に対しても耐性を示した。葉緑体DNA のtRNA のtrnL – trnF 領域および核ゲノムDNA の5S RNA 遺伝子とその両端のスペーサー配列を含むITS 領域の塩基配列を解析した。その結果、葉緑体のtRNA 領域（約1000 塩基対）は完全に一致し、ITS 領域（約640 塩基対）では3 種は互いに数塩基（1％以下）異なるのみであり、分子系統学的比較においてもキイシモツケはイワシモツケおよびトサシモツケと極めて近縁であることが証明された。したがって、キイシモツケは日本の近畿以北に広く分布するイワシモツケを起源とし、和歌山の限られた蛇紋岩地帯に適応して、地理的に隔絶して自生するにいたったエコタイプであると推測された。A plant called Kiishimotsuke（ in Japanese） is indigenous to Wakayama prefecture in Japan. The plant vegetates only in the three narrow mountain areas consisting of serpentine soils. The largest colony of this plant in the area of Mt. Ryumon higher than 600 m above sea level had been designated as a prefectural natural treasure since May 1971. The plant was first discovered by Y. Ogawa, a botanist in Iwade city, and registered as a new species with a name of Spiraea ogawai Nakai in 1928. However, the validity of this registration was questioned later, because there were two kinds of plants, called Iwashimotsuke and Tosashimotsuke, which were morphologically similar to Kiishimotuke except for the shape of leaves. Iwashimotsuke is vegetating in northern area than Kinki district, and Tosashimotsuke indigenously in Kochi prefecture. Thus at present Iwashimotsuke is named as Spiraea nipponica Maxim, Tosashimotsuke as S. nipponica Maxim var. tosaensis（ Yatabe） Makino, and Kiishimotsuke as S. nipponica Maxim var. ogawae （Nakai） Yamanaka. In view of recent progress of molecular phylogenetics, the conventional method was employed to examine whether Kiishimotsuke is a species intimately related to the other two plants or not. The nucleotide sequences were determined for the regions of trn L – trn F of chloroplast DNA and ITS （Internal Transcribed Spacer） of 5S RNA coding region of nuclear DNA. The results showed that the differences in the sequences were less than 1％ among the three, demonstrating their close evolutionary relationships. Thus it is reasonable to conclude that Kiishimotsuke is a variety or ecotype of S. nipponica based not only on morphological comparison but also on molecular phylogenetic analysis. Unexpectedly significant difference in the sequence of the ITS for Iwashimotsuke（ Spiraea nipponica Maxim） was found between the one published by Potter et al.（ DQ897622） and ours（ LC133174 and LC13375）. The difference remains to be elucidated. Since Kiishimotsuke is endemic to serpentine soils in Wakayama, the interaction of the plant with serpentine soils was also studied. When these three plants were raised from seeds on non-serpentine cultivation soils, all of them grew normally and the differences in the shape of the leaves were retained, indicating the shapes of leaves were not affected by the kind of soil but determined inherently. Nikkel ion is known to be one of the most toxic metal ions in serpentine soils. When the effects of increasing concentrations of Ni 2 + on the sprouting of seeds were tested, Kiishimotsuke was most tolerant among others. In the aboveground parts of Kiishimotsuke plants grown on serpentine soils of Mt. Ryumon, accumulation of Ni 2 + was confirmed and its possible significance of the plant survival was discussed.

Plant disease resistance gene (R gene)-like sequences were screened from the Physcomitrella patens genome. We found 603 kinase-like, 475 Nucleotide Binding Site (NBS)-like and 8594 Leucine Rich Repeat (LRR)-like sequences by homology searching using the respective domains of PpC24 (Accession No. BAD38895), which is a candidate kinase-NBS-LRR (kinase-NL) type R-like gene, as a reference. The positions of these domains in the genome were compared and 17 kinase-NLs were predicted. We also found four TIR-NBS-LRR (TIR-NL) sequences with homology to Arabidopsis TIR-NL (NM_001125847), but three out of the four TIR-NLs had tetratricopeptide repeats or a zinc finger domain in their predicted C-terminus. We also searched for kinase-LRR (KLR) type sequences by homology with rice OsXa21 and Arabidopsis thaliana FLS2. As a result, 16 KLRs with similarity to OsXa21 were found. In phylogenetic analysis of these 16 KLRs, PpKLR36, PpKLR39, PpKLR40, and PpKLR43 formed a cluster with OsXa21. These four PpKLRs had deduced transmembrane domain sequences and expression of all four was confirmed. We also found 14 homologs of rice OsXB3, which is known to interact with OsXa21 and is involved in signal transduction. Protein-protein interaction was observed between the four PpKLRs and at least two of the XB3 homologs in Y2H analysis.

Studies on extracellular proteins (ECPs) contribute to understanding of the multifunctional nature of apoplast. Unlike vascular plants (tracheophytes), little information about ECPs is available from nonvascular plants, such as mosses (bryophytes). In this study, moss plants (Physcomitrella patens) were grown in liquid culture and treated with chitosan, a water-soluble form of chitin that occurs in cell walls of fungi and insects and elicits pathogen defense in plants. ECPs released to the culture medium were compared between chitosan-treated and nontreated control cultures using quantitative mass spectrometry (Orbitrap) and 2-DELC-MS/MS. Over 400 secreted proteins were detected, of which 70% were homologous to ECPs reported in tracheophyte secretomes. Bioinformatics analyses using SignalP and SecretomeP predicted classical signal peptides for secretion (37%) or leaderless secretion (27%) for most ECPs of P. patens, but secretion of the remaining proteins (36%) could not be predicted using bioinformatics. Cultures treated with chitosan contained 72 proteins not found in untreated controls, whereas 27 proteins found in controls were not detected in chitosan-treated cultures. Pathogen defense-related proteins dominated in the secretome of P. patens, as reported in tracheophytes. These results advance knowledge on protein secretomes of plants by providing a comprehensive account of ECPs of a bryophyte.

自然植生下に成育するイヌガヤを材料にして，光条件が成育とアルカロイド組成の特性におよぼす影響について検討した．イヌガヤは，光強度（相対値）が弱く，多くの場合太陽直射光の20 ％以下の環境で成育していた．イヌガヤの成育には光強度（相対値）が影響しており，樹高と樹径は光強度（相対値）と正の相関があった．また，樹高と樹径との間には高い相関があった．環境の異なる2地域（静岡県富士郡と沼津市）のイヌガヤを分析した結果，光強度が弱い環境に成育する静岡県富士郡のイヌガヤにはHHTが多く，光強度が強い環境に成育する沼津市のイヌガヤにはHTが多かった．アルカロイドの組成に光が関与することが考えられたので，太陽直射光下に成育する樹木個体を選抜し，太陽直射光の照射下にある南側（高照度環境）と太陽光がさえぎられて散乱光が照射されている北側の枝（低照度環境）のアルカロイド組成を比較した結果，前者ではHT，後者ではHHTが多かった．

エゾスナゴケ原糸体の無菌培養物を長期間簡易に維持する方法について検討した．エゾスナゴケの原糸体は，胞子嚢を表面殺菌することによって得た．原糸体培養物は，急激な凍結にも耐えた．また，前処理無しで-80 ℃に移しても，そのまま少なくとも1年間保存することが可能であり，再度培養を行うと生育を開始した．この結果から，エゾスナゴケの培養株を簡易に保存できることがわかった．

Completely closed bags made with a gas permeable film are available for culture of two aquatic plants, Eleocharis vivipara and Sphagnum nemoreum. E. vivipara, the C3-C4 photosynthesis interconvertible plant, was successfully grown in a sugar free liquid medium and developed C3 type culms even under relatively high intensity of illumination. Growth of S. nemoreum was clearly stimulated in the bag using a sugar containing medium. The film system is promising for further study of responses to environmental factors such as intensity and wavelength of illumination.

Production of apoplastic reactive oxygen species (ROS), or oxidative burst, is among the first responses of plants upon recognition of microorganisms. It requires peroxidase or NADPH oxidase (NOX) activity and factors maintaining cellular redox homeostasis. Here, PpTSPO1 involved in mitochondrial tetrapyrrole transport and abiotic (salt) stress tolerance was tested for its role in biotic stress in Physcomitrella patens, a nonvascular plant (moss). The fungal elicitor chitin caused an immediate oxidative burst in wild-type P. patens but not in the previously described delta Prx34 mutants lacking the chitin-responsive secreted class III peroxidase (Prx34). Oxidative burst in P. patens was associated with induction of the oxidative stress-related genes AOX, LOX7, and NOX, and also PpTSPO1. The available delta PpTSPO1 knockout mutants overexpressed AOX and LOX7 constitutively, produced 2.6-fold more ROS than wild-type P. patens, and exhibited increased sensitivity to a fungal necrotrophic pathogen and a saprophyte. These results indicate that Prx34, which is pivotal for antifungal resistance, catalyzes ROS production in P. patens, while PpTSPO1 controls redox homeostasis. The capacity of TSPO to bind harmful free heme and porphyrins and scavenge them through autophagy, as shown in Arabidopsis under abiotic stress, seems important to maintenance of the homeostasis required for efficient pathogen defense.

Bryophytes, or mosses, are considered the most maintenance-free materials for roof greening. Racomitrium species are most often used due to their high tolerance to desiccation. Because they grow slowly, a technology for forcing their growth is desired. We succeeded in the efficient production of R. japonicum in liquid culture. The structure of the microbial community is crucial to stabilize the culture. A culture-independent technique revealed that the cultures contain methylotrophic bacteria. Using yeast cells that fluoresce in the presence of methanol, methanol emission from the moss was confirmed, suggesting that it is an important carbon and energy source for the bacteria. We isolated Methylobacterium species from the liquid culture and studied their characteristics. The isolates were able to strongly promote the growth of some mosses including R. japonicum and seed plants, but the plant-microbe combination was important, since growth promotion was not uniform across species. One of the isolates, strain 22A, was cultivated with R. japonicum in liquid culture and in a field experiment, resulting in strong growth promotion. Mutualistic symbiosis can thus be utilized for industrial moss production.

Bryophytes (mosses) are non-vascular plants inhabited by a large number of fungal species, but whether mosses can act as reservoirs of fungal pathogens of crop plants has gained little attention. A few moss species including the Sunagoke moss (Racomitrium japonicum; family Grimmiaceae) are found to have modern economical applications in uses such as greening of urban environments. In a previous study, we identified fungi causing symptoms of varying severity in the commercially grown Sunagoke moss. The aim of this study was to test whether the same fungal isolates are pathogenic to vascular plants. An isolate of Fusarium avenaceum lethal to the Sunagoke moss caused root and crown rot in barley (Hordeum vulgare) and reduced germination of tomato (Solanum lycopersicum) and carrot (Daucus carota) grown in the infested soil. An isolate of Cladosporium oxysporum causing mild symptoms in moss reduced growth and caused reddening and premature death of carrot seedlings. On the other hand, isolates of Alternaria alternata and Fusarium oxysporum lethal to the Sunagoke moss caused no detectable symptoms in any tested vascular plant, suggesting specialisation of these isolates to moss. Chloroplast repositioning was observed in the neighbouring cells towards the initially infected cell following infection with F. avenaceum and A. alternata in Physcomitrella patens (family Funariaceae), a model moss used to study microscopic symptoms. Infection of P. patens with a non-virulent Apiospora montagnei isolate induced formation of papillae in the moss cells, indicating activation of host defence as described in vascular plants. Results suggest that mosses and vascular plants may be linked by a common microbial interface constituted by pathogenic fungi. The findings have epidemiological implications that have gained little previous attention.

本論文では，工業生産のための植物バイオテクノロジーを課題として，マイクロプロパゲーションによるクローン植物の苗生産，二次代謝産物および異種タンパク質の生産への応用について述べた．クローン植物の生産のための生産システムは，組織培養施設を含む工業的規模の生産施設であり，最近ではバイオリアクターを使用する効率の高い生産施設へのスケールアップの実用化も始まっている．二次代謝産物や異種タンパク質の生産への植物バイオテクノロジーの応用は，様々な発現制御の手段を駆使して生産条件の最適化が検討されており，すでに，大規模なバイオリアクターによる二次代謝産物の生産が実用化されている．さらに，真核生物を起源とする様々な異種タンパク質を植物で発現できるようになり，商業的にも興味深い代謝物質の生産研究が進展している．

Drought and heat tolerance of the Sunagoke moss (Racomitrium japonicum) and the low thermal conductivity of the dry moss tissue offer novel greening and insulation possibilities of roofs and walls to mitigate the heat island phenomenon in urban environments. However, damage may appear in the moss panels under humid conditions in Japan. In this study we characterized fungi associated with the damaged areas of the Sunagoke moss panels. Fungi were identified by morphology and internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis and tested for pathogenicity on R. japonicum (Grimmiaceae) and an unrelated moss species (Physcomitrella patens; Funariaceae) under controlled conditions. Alternaria alternata, Fusarium avenaceum and Fusarium oxysporum caused severe necrosis and death, whereas Cladosporium oxysporum and Epicoccum nigrum caused milder discoloration or chlorosis in both moss species. The fungi pathogenic on moss were closely related to fungal pathogens described from cultivated vascular plants. Ammonium increased severity of fungal diseases in moss. This study demonstrated that fungi can cause economically significant diseases in cultivated moss and hamper commercial use of the moss panels unless appropriate control methods are developed. Use of a single moss clone to cover large surfaces and the air pollutants such as ammonium may increase the risk for fungal disease problems. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

The use of Racomitrium japonicum, a drought resistant bryophyte used for roof-greening, is gradually increasing. However, its utilization is hampered by slow growth rate. Here we isolated culturable bacteria from hydroponic cultivation samples to identify isolates that could promote moss growth. Most of the isolates belonged to Pseudomonas, Rhodococcus, and Duganella species. The isolates were biochemically characterized according to their type of interaction with plants, i.e., production of auxin, siderophores, or hydrogen cyanate, growth in the absence of an added nitrogen source, calcium phosphate solubilization, utilization of sugars, polymers, or aliphatic compounds, and antifungal activity. The isolates were applied to sterile protonemata and non-sterile adult gametophytes of R japonicum to evaluate their effect on plant growth. Furthermore, we isolated fungi that inhibited moss growth. Our results suggest that the microbial community structure in hydroponic cultures is important to stabilize moss production and the isolates that promote moss growth have potential to be utilized as biofertilizers for moss production. (C) 2011, The Society for Biotechnology, Japan. All rights reserved.

植物工場生産を高効率化・高付加価値化するための２つのアプローチ、すなわち、植物を改変するための生物学的アプローチ、および、空間や光の効率的利用などに関する工学的アプローチの２つについて概説した。

メチロトローフ細菌のRibulose Monophosphate経路にかかわる2つの遺伝子を導入した植物では、ホルムアルデヒドを固定して利用できることを明らかにした。（英文）

われわれは陸生型Eleocharis viviparaのC_4光合成型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)の環境応答や酵素の活性調節などの研究の過程で、このPEPCが従来から広く植物材料に対して用いられてきた、不溶性のポリビニルポリピロリドン(PVPP)を助剤とする抽出法ではほとんど抽出されないという困難に遭遇した。本研究ではこの問題を解決するため、抽出方法の検討を行った。その結果、スキムミルク (Skim milk) が助剤として非常に有効であることを見出し、PEPCの抽出効率を飛躍的に高めることに成功した。詳細な解析の結果、Skim milkの主成分であるカゼイン(Casein)がPEPC抽出に有効であることを示し、さらにCaseinよりも溶解性の高いCaseinのナトリウム塩(Casein sodium salt)の方が高い効果を示すことを見出した。Caseinの主要構成成分であるα-、β-、及びK-caseinはいずれも同程度に有効であった。通常は、PVPPを助剤として用いる場合には可溶性のポリビニルピロリドン(Polyvinylpyrrolidone, PVP)をさらに加えることはないが、われわれは偶然、PVPをPVPPと併せて用いてみたところ、抽出効率が非常に良くなることを観察し、PVPにはPVPPにはない抽出能力があることを見出した。平均分子量を異にするPVPについて検討した結果、平均分子量が約10,000と小さいものが最も有効であった。さらに、本抽出法の応用性及び新たな可能性について論じた。Departmental Bulletin Paper

Physcomitrella patensをキトサン処理するとすばやく培地中にペルオキシダーゼが放出されることを見出した。このペルオキシダーゼは、コケがカビによる攻撃から自らを防御するうえで重要であることを証明した（英文）。

カイコ細胞質多角体病ウイルス由来のポリヘドリン遺伝子と、ポリヘドリンと相互作用して多角体に包埋されるタンパク質であるVP3遺伝子とを植物細胞内で同時に発現させ、多角体を形成させることを試みた。ポリヘドリン遺伝子と、GUS遺伝子に連結したVP3遺伝子とが同時に発現するように各々CaMV35Sプロモーター下においた。このように作成したベクターを用いてタバコBY-2細胞を形質転換したところ、選抜マーカーに対する耐性を示す細胞塊が複数得られた。顕微鏡観察したところ、GUS染色しても多角体と明らかにわかる粒子を含む細胞はなかった。ポリヘドリン抗体を用いたウエスタン解析の結果から、このタンパク質が組換えタバコBY-2細胞で生産されていることが明らかになった。

A cherry (Cerasus x yedoensis Matsum.) was mass propagated using tissue culture techniques. Shoot primordia were efficiently induced on a solid MS medium containing 30 g L-1 sucrose, 0.5 mg L-1 BA, 0.1 mg L-1 IBA and 3 mg L-1 GA(3). The primordia were maintained and proliferated using the same medium or a liquid medium whose composition was the same with the solid medium except elimination of agar. The primordia were also successfully propagated in a bioreactor. Shoots were regenerated on a modified MS solid medium in which the concentration of major inorganic salts (KNO3, NH4NO3 and CaCl2) was reduced by half, and sucrose and hormone concentrations were the same as that of medium for the primordia. Root formation was clearly inhibited in this medium but it was stimulated by subculturing the plants on the medium without growth regulators. Plantlets were successfully acclimatized on 1:1 mixture of Kanuma-soil (a weathered pumice) and vermiculite. A culture scheme for efficient system for mass propagation of cherry is discussed.

古代ギリシアの医師ヒポクラテス(BC460頃-377頃)は、医術に携わることを志す者が立てる誓いを定めた。「医術の神アポロン、アクレピオス、ヒギエイア、バナケイアおよびすべての神々に誓う、私の能力と判断に従ってこの誓いと約束を守ることを」という言葉で始まるヒポクラテスの誓い(Hippocratic oath)の中に、「私の能力と判断に従って患者に利益すると思う医術の療法を用い、悪くて有害と知る方法を決して用いない」という言葉がある。すなわち、生命はかけがえのないものであり、生命に加えるすべての行為から生じる利益は害悪を上回るものでなければならないということである。この誓いは、生命体に影響を及ぼす医術という行為にっいて、倫理的な配慮が必要であることを古代ギリシアの時代から医師という専門家が認識していたことを示すものである。現代に至り、生命の神秘さを遺伝子のレベルで解明し、更には遺伝子を取り出したり組み換えたりする技術を手にした科学者は、古代ギリシアの医師と同じように、生命体に影響を及ぼす行為がもたらす利益(善)と弊害(悪)のバランスについて真剣に考えねばならない。特に農作物は人類を養う食糧の根幹であって生命体に直接影響するがゆえに、その遺伝子組換えにっいては注意深い検討が必要である。また、例え善を目的として研究が行われたとしても、遺伝子組換え作物の是非に対する最終的な判断は、消費者が受け入れるか否かである。消費者がその是非についての判断を下すためには、正しい情報が消費者に提供されなければならない。特に、遺伝子組換え技術を用いて研究し、かつ学生を教育する立場にある者には、安全性や倫理的側面について十分に考え、学生の教育を通じて世の中に正しい情報を提供する責務がある。本論文では、遺伝子組換え作物とはどのようなものであるか、そして遺伝子組換え作物栽培の現状について簡単に述べた後に、遺伝子組換え作物に対する倫理的側面-特に安全性、そして将来に向けての展望-について考察する。

Vascular plants have various inducible resistance mechanisms as defense against pathogens. Mosses, small nonvascular plants (subkingdom Bryophyta), have been little studied in regard to their pathogens or modes of defense. Data here show that Erwinia carotovora, a bacterial plant pathogen that causes softrot in many dicotyledonous plants, can also cause soft rot symptoms in the moss Physcomitrella patens. Infection of moss by E. carotovora required pathogenicity factors similar to those required to infect vascular plants and, again as in vascular plants, salicylic acid (SA) induced moss to inhibit tissue maceration by Erwinia. These data reveal that SA-dependent defense pathways may have evolved before differentiation of vascular and nonvascular plants. © The Phytopathological Society of Japan and Springer-Verlag 2005.

Bioreactors are an efficient tool for the production of plant propagules but, at present, their application is commercialized in only a few tissue culture companies. The present article reviews practical aspects of the use of bioreactors in the mass propagation of plants in relation to the responses of plant propagules in liquid medium, the characteristics of bioreactor culture techniques in plant propagation and discusses case studies of the use of bioreactors for several plant species including Fragaria ananassa, Lilium species, Hippeastrum hybridum, Gladiolus grandiflorus, Spathiphyllum, Colocasia esculenta and Solanum tuberosum. The establishment of plantlets from bioreactors and future prospects are also described.

A simple method of genetic transformation of leaf lettuce (Lactuca sativa L.) by infection of the seeds with Agrobacterium tumefaciens was investigated. Sterilized and water-imbibed seeds were vacuum-infiltrated with a suspension of A. tumefaciens that harbored pIG121-Hm. After co-cultivation, the shoot primodium tissue was induced on a medium that contained antibiotics, for elimination of the bacteria and selection of transgenic cells. Plants regenerated on the selection medium showed GUS activity. These results indicated that transgenic leaf lettuce can be developed using the seed infiltration method.

リーフレタスのシュート誘導系とそれを利用した遺伝子導入系の開発を試みた.茎頂組織を材料としサイトカイニンとしてBAを含む培地により液体回転培養した結果,苗条原基を効率よく誘導することができた.得られた苗条原基からは容易にシュートが誘導でき発根させることができた.また,苗条原基に対してAgrobacterium tumefaciensによるGUS遺伝子の導入を試みたところ,選択マーカー(カナマイシンとハイグロマイシン)に耐性を示す個体が得られた.これらの個体から葉を採取し,GUS活性を測定した結果,強い活性を示した.

植物を宿主として生理活性タンパク質や医療用タンパク質を生産する技術が、近年長足の進歩を遂げつつある。植物には異種タンパク質生産系として、低コストでの大量生産、分離精製の容易さ、安全性など多くの利点がある。本総説では植物がもつこのような利点を生かして、生理活性タンパク質や食べるワクチン、抗体、自己免疫疾患治療タンパク質など、主として医療用タンパク質を植物に生産させるmoleculasfarmingに関する研究の動向を述べる。

Plant disease resistance (R) genes encode proteins in which several motifs of the nucleotide-binding region (NBS) are highly conserved. Using degenerate primers designed according to the kinase 1 (P-loop) and hydrophobic (HD) motifs of the R gene NBS domains, homologous sequences were cloned from moss (Physcomitrella patens; phylum Bryophyta) representing an ancient nonvascular plant. A novel gene family (PpC) with at least eight homologous members was found. Expression of five members was detected. The level of expression was dependent on the developmental stage of moss, being higher in the gametophyte tissue than in the protonema tissue. The PpCs contained the conserved motifs characteristic of the NBS regions of R genes, and a kinase domain was found upstream from the NBS region. Phylogenetic analysis using the deduced NBS amino acid sequences of the PpCs and the plant genes available in databanks indicated that the PpCs show the closest relationship with the TIR-NBS class of R genes. No significant similarity to plant genes other than R genes was observed. These findings shed novel light on the evolutionary history of the R gene families, suggesting that the NBS region characteristic of the TIR-NBS class of R-like genes evolved prior to the evolutionary differentiation of vascular and nonvascular plants.

Storage organ of Dioscorea opposita was efficiently generated by using a drum type bioreactor. This reactor was not equipped with a system for mechanical aeration and explants were immersed intermittently into the medium on rotation. When explants precultured on a rotary shaker were transferred to the bioreactor, approx. 230 pieces of storable organs that could be bulbils or microtubers were generated after 5 weeks. These organs sprouted within a week and eventually grew into normal plants. © 2002, Japanese Society for Plant Cell and Molecular Biology. All rights reserved.

Growth of root of sweet potato (Ipomoea batatas Lam) was significantly stimulated using a Ebb and Flow type culture system.

The effect of Tiron (disodium 1,2-dihydroxybenzene-3,5-disulfonate) on the growth, morphology and alkaloid content of adventitious roots in Atropa belladonna was investigated. High concentrations of Tiron had an inhibitory effect on growth of the root. The appearance of cultured roots was significantly changed from rough roots accompanied with callus-like tissue in control cultures to fine roots without callus formation. Alkaloid content was drastically increased by the addition of 1 mM Tiron to the medium. The influence of NAA, which has an inhibitory effect on alkaloid production, was partially restored by Tiron treatment, indicating that this radical scavenger may affect the production of alkaloids through modulation of the mode of action of auxin. Glutathione content of the root was not influenced by Tiron.

The production of thymol was investigated in a bioreactor culture of plantlets of Thymus vulgaris. The plantlets successfully multiplied in a liquid shake culture, but the thymol content was quite low compared to the static culture. When the plantlets were cultured using a non-mechanical agitated type of bioreactor, the plantlets grew well and the productivity of thymol (mol/dry weight of plantlets) was the almost the same as that of the static culture. Most of thymol (approx. 80%) was contained in the medium. When an ebb and flow type of culture system (EFBR type) was used as the bioreactor, the growth was stimulated and the productivity of thymol was increased whereas the medium contained only a small amount of thymol (7% of the total thymol). The EFBR type is thought to be suitable for the multiplication of plantlets and the production of thymol.

継続後誌:近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University培養由来のサトイモ貯蔵器官(球茎)の苗質を評価する目的で、培養直後の球茎の乾燥耐性および球茎中に含まれる貯蔵物質(デンプン、レクチン)の含量を測定した。培養由来の球茎は、実験室内において速やかに萎れた。貯蔵物質の含量は市販の球茎よりも著しく低かった。これらの結果から、培養由来の球茎は貯蔵器官としての発達が不十分と判断された。培養条件によって貯蔵物質の含量は影響され、その含量は順化率に関係する可能性が示唆された。 （英文） Quality of in vitro propagated corms of yam (Colocasia esculenta cv. Ishikawawase) as the seed plants was estimated. In vitro derived corms were easily wilted when they were kept under the room condition. The contents of two kinds of reserve substances, starch and lectin, were significantly less than those in the field grown corms. These results indicate that development as the storage organ is insufficient in in vitro propagation of corms. Composition of the medium influenced on the content of these reserve substances which may affect on the efficiency of acclimatization of the corms.

We have developed a simple system for mass propagation of plant organs using a bioreactor without forced aeration. In this system, explants were cultured in bottles equipped with an air-permeable membrane on the cap and these bottles were slowly rotated on a bottle roller. Microtubers of potato were induced using a two-step culture method. In the first step, potato plantlets were cultured under static conditions. After shoot proliferation, the culture medium was replaced with a medium containing a higher concentration of sucrose and the bottles were rotated at 1 rpm. The number of tubers was clearly increased in this system compared to the culture without rotation. The results indicated that our system can be applied for mass propagation of potato tubers at low cost.

Small cell clusters with high taxol contents were selected in the following manner. Cell suspensions derived from Taxus brevifolia and Taxus cuspidata were reacted with primary polyclonal antibodies of taxol, and then labeled by magnetic or fluorescent (FITC) secondary antibodies. Cell clusters bound to the secondary antibodies were picked up manually by a small magnet or through a fluorescence microscope. It was possible to seperate cell clusters having taxol contents of more than 1000 mu g/g DW from cell suspensions which had an average taxol content of 5 mu g/g DW pr less.

植物の分化した組織および器官を培養するための装置を開発し、Atropa belladonna(ベラドンナ)の不定根培養系を用いて、その有用性を確かめた。この新たに開発された10-L容の培養装置内では、ベラドンナ根は集塊を形成することなく良好に増殖した。一般的な通気型培養槽で培養した場合と比較し、この培養装置を用いた場合には、培養開始後72日目で、根量については約1.5倍、アルカロイド含量については約2倍に増大させることができた。

We developed an apparatus for inoculation of a large number of plantlets or plant parts such as shoots or roots into a large-scale fermenter at one time. Ab opa belladonna adventitious roots (2.4 kg FW) were inoculated into a 500 l fermenter under sterile conditions, and 35 kg FW of the roots were obtained after 60-d cultivation. There were no differences in proliferation rate and scopolamine content between a 10 l fermenter culture used as control and the 500 l fermenter culture. The success of large-scale root culture was considered to be dependent on the use of the new inoculation apparatus.

Plant regenerated organs such as shoots, bulbs, microtubers, corms, embryos, etc. have been successfully proliferated in the bioreactor. The use of a bioreactor leads to the development of technology suitable for large scale plant propagation. The basic construction and characteristics of various types of bioreactor systems are reviewed in relation to shoot and embryo cultures. A pilot scale 500 liter bioreactor system was applied to the production of large scale Stevia rebaudiana shoots.

The shoot primordium is a suitable inoculant for large scale culture of shoots comparing with the shoot. itself. A culture method of multiple shoots starting from the shoot primordium was established. The influence of scale up conditions on the growth of multiple shoots originating from the primordia was also investigated.
Shoot primordium of Stevia rebaudiana has been induced and maintained in modified MS liquid medium containing NAA and BA. The primordia grew constantly by about 7 times in 1 month in the liquid shake culture. The multiple shoots were then induced efficiently from the primordia by eliminating the growth hormones from the MS medium. They grew constantly by about 20 times in 1 month in the liquid shake culture. The growth of shoots in culture vessels of different sizes, 0.3 l (flask), 6 l (jar fermentor) and 500 l (bioreactor), were compared by inoculating the primordia at a fixed density of about 10 gl^-1. The shoots grew actively to fill up culture vessels within a month, and the final weight of shoots per unit volume of medium was similar in each culture vessel. This result strongly suggests that multiple shoots can be mass propagated in a large scale without affecting the culture efficiency.

Development of an efficient system for shoot mass propagation through the entrapment of shoot primordia was investigated on Stevia rebaudiana. Shoot primordia of Stevia rebaudiana could be trapped into cubes of reticulate form matrix of loofah, sponge of Luffa aegyptica, when the primordia were cultured in a rotary culture system (flask scale) or in the drum type jar fermentor system in the presence of the cubic matrices. The shoot primordia grew to form uniform clumps staying in loofah matrices and the growth was stimulated by the entrapment compared to the control culture without the matrices. Shoots were efficiently induced from the entrapped clumps of primordia under subsequent static culture condition and were acclimatized successfully without removing the matrices.

Potato (Solanum tuberosum L.) tubers were mass propagated in a jar fermentor using a two-step method consisting of a shoot multiplication step (phase 1) followed by a tuber induction and development step (phase 2). Tuberization was observed within 2 weeks of phase 2 and the number of tubers did not increase after this culture period. In contrast, total tuber weight continuously increased for at least 10 weeks. Although the number of tubers and the total tuber weight clearly decreased under the lower temperature (17-degrees-C), this weight decrease was partially prevented by changing the temperature from 17-degrees-C to 25-degrees-C after 2 weeks of phase 2. This result indicates that tuber development can be controlled independently of induction. Lower temperatures influenced the localization and size distribution of tubers in the jar fermentor.

A procedure for the mass propagation of potato (Solanum tuberosum L.) tubers using a laboratory scale jar fermentor is described. Tuberization was clearly suppressed when the shoots were completely submerged in the liquid medium. Tubers were mainly formed at the medium surface. When shoots were cultured by the semi-continuous medium surface level control method, in which the medium surface level was raised or lowered throughout the culture period, tubers were induced and developed in every area in the jar fermentor. Tubers propagated by this method contained about 18 % (w/w) dry matter, slightly less than in field grown tubers, but most of the tubers weighing more than 0.2 g(FW) sprouted under room condition, without any acclimatization, during 3 month after the culture.

A procedure for the mass propagation of multiple shoots of Stevia rebaudiana is described. Isolated shoot primordia were used as the inoculum to obtain clusters of shoot primordia. Such clusters were grown in a 500 liter bioreactor to obtain shoots. A total of 64.6 Kg of shoots were propagated from 460 g of the inoculated shoot primordia. These shoots were easily acclimatized in soil.

ジャーファーメンターを用いて大量培養したジャガイモ塊茎の休眠と圃場における生育および収量を調べた. 培養終了後1週間で, 約40%以上の重量を失う塊茎では, 他と比べ明瞭な萌芽の遅れが見られた. 圃場における生産性は, 播種した塊茎重量にはあまり関係しなかったが, 萌芽の遅れが生産性の低下をもたらす一因となっていた。これらのことから, 圃場における生産性の低い塊茎の一部は培養終了後の重量変化によって選別できるものと考えられた.

植物体を予め増殖させたのちに培養条件を変更してジャガイモ塊茎を誘導する2段階培養法を, 小型ジャーファーメンターによる培養に応用した. 液体培地中で増殖させた植物体上には塊茎がほとんど誘導されず, 培地液面位置を調節することで塊茎形成数を著しく増大させることができた. 塊茎の肥大は液体培地表面付近に著しく偏っておこり, このことによって, 塊茎重に大きなばらつきを生じた. 一方, 形成された塊茎の乾物率は, 形成場所や大きさに係わらずほぼ一定であった.

The suspension culture of high anthocyanin-producing Aralia cordata cell lines, which grow and produce anthocyanin without light irradiation, was scaled up from flasks to a 10-1 glass jar fermenter, a 95-1 stainless steel jar fermenter, and finally a 500-1 pilot-scale jar fermenter. By the administration of CO2, cell damage was completely prevented and the anthocyanin content was kept as high as 7.0-17.2% (w/w) of the dried cells. In one of the operations of the 500-1 jar fermenter, cells were cultivated for 16 days. During this operation, cell mass was increased by more than 26 times (cell yield: 69.2 kg fresh wt.) and the amount of anthocyanin increased by more than 55 times (anthocyanin yield: 545 g, anthocyanin content: 17.2% of the dried cells).

マセチレン阻害法を用いて, 温室ポット栽培の水稲および陸稲根圏における硝化-脱窒活性をin situ 条件下で測定した. その結果, 水稲根圏において, 生育初期には硝化-脱窒活性の促進が認められ, 出穂期にはさらに活性が高まるものの, 完熟期には消失することが明らかとなった. また, 根圏の硝化-脱窒活性は, 地上部における光合成作用の影響を著しく受けることが明らかとなった. これに対して, 非根圏では, 比較的初期に脱窒活性が認められたが, 以降消失した. また, 得られた活性値も小さかった. 一方, 畑条件下の根圏では, 硝化-脱窒活性が認められなかったが, 土壌水分が最大容水量条件では脱窒活性が認められたことから, 本実験条件下では, 土壌水分が, 脱窒作用の制限要因となっていたことが推定された.

植物の遺伝子操作について、その原理や応用、および、研究手法を紹介した。

P2-11

P2-09

P2-08

発表番号 P-107、要旨集 p182

発表番号 P-049, 要旨集 p153

発表番号P-047, 要旨集p152

若狭東高等学校において高校生対象に表記タイトルの講演を行った。

ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）には、植物病害抵抗性遺伝子のホモログ（PpC24）が見られる。これまで明らかでなかった部分配列を明らかにした。また、そのノックアウト株の性質を明らかにした。

HPSとPHIを導入することによってホルムアルデヒド耐性を付与した遺伝子組換えシロイヌナズナと野生株をホルムアルデヒドに暴露した。暴露実験には、この目的に特注したシステムを用いた。暴露後の植物のトランスクリプトームを解析した。結果、ホルムアルデヒド暴露時にみられる特徴的な遺伝子発現レベルの変化を観察でき、そのいくつかは、形質転換株で応答性が低かった。（英文）

エゾスナゴケ（Racomitrium japonicum）の原糸体の無菌培養系を誘導した。その培養特性を報告した。

スナゴケ（Racomitrium japonicum）がカビによる被害を受けることを紹介し、その際に検出されるカビのうちin vitroでコケが被害を受けると同定できたものを報告した。

ポリヘドリンからなる多角体に変異型チオレドキシンを包埋させることにより、チオレドキシンと相互作用するタンパク質を分離しうることを明らかにした。

「未来型植物工場-分子情報利用技術からロボット利用技術まで-」と題したオーガナイズドセッションにおいて、コケの病害応答を例に植物を分子レベルから調べる研究法について概説した。

スナゴケが緑化用の資材として、および、植物とカビ性の病原菌との関係を調べる材料として価値があることを紹介した（英文）。

スナゴケから、その生育を促進するメチロトローフを単離しその効果を確かめた。

ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）がキトサンに応答してすばやく培地中にペルオキシダーゼを放出すること、および、そのペルオキシダーゼをノックアウトしたときの影響を報告した（英文）

コケ（Racomitrium japonicum）から単離されたメチロバクテリウムが植物の生育を促進することを紹介し、その分子的基盤について考察した（英文）。

スナゴケ（Racomitrium japonicum）の生育を促進するメチロトローフ細菌を単離し、その効果を確かめた。

「レタスの種子感染による遺伝子組換え法」について報告した

コケの無菌培養系を利用した研究の実例を紹介し、その可能性を明らかにした。

「植物のDNAやRNAを扱う意義と基本的方法」というタイトルで研究の概要を解説した。

環境中のホルムアルデヒド(HCHO)を吸収・同化する能力を植物に付与することにすでに成功しているが、本研究では実用化をめざして、この能力のさらなる増強のための導入遺伝子の改良を行い、HCHO の毒性発現機構の一部を解明し、シロイヌナズナ、タバコに加えてイネにもこの能力を付与することに成功した。将来メタンの資化能を植物に付与するための次のステップとしてメタノールの資化能を付与する試みを行った。

コケ緑化の事業化を目指す諸課題のうち、種苗の無菌培養法、肥料開発、病害の発生可能性について分担した。

メタノール資化性細菌のホルムアルデヒド(HCHO)固定に関与する2種類の酵素の遺伝子をシロイヌナズナ(At)およびタバコに導入し、形質転換体を取得した。形質転換体はHCHOの吸収能が増強され、高い耐性を示した。Atを用いてHCHOに応答して発現量が変化する遺伝子を網羅的に解析し、毒性および組換え体の耐性機構について手がかりを得た。植物において最も強く発現できるように遺伝子を合成し、これをAtおよび数種類の観葉植物に導入して、シックハウスガスの低減化に役立つ植物の作出を試みた。

緑化用のスナゴケの無菌増殖系の誘導とその効率的な増殖条件、分化条件の検討を行った。また、スナゴケの液体増殖に適当な肥料の開発も試みた。

カイコ細胞質多角体病ウイルスの多角体形成に関与するポリヘドリン遺伝子と、VP3にマウス由来のFosBを接続したキメラ遺伝子を含むバイナリーベクターを作成し、アグロバクテリウムを介してレタスやタバコBY-2細胞などを形質転換した。結果、ウエスタン法による検出ができたものの含量が少なく、生産物のサイズが小さくなっていたなど、さらに検討を要する問題が多いことが明らかになった。そこで、当初の予定を変更し、相互作用するタンパク質の分離が多角体を用いて可能かどうかをカイコ培養細胞を使って調製した多角体を使って確かめることにした。研究では、ホウレンソウ由来のチオレドキシン(Trx-m)を提示させた多角体を作成し、これを用いてTrx-mと相互作用するタンパク質群の分離を試みた。Trx-mとして、S-S結合の形成に関与するシステイン残基の一つをセリンに置換したTrx-m_を用いた。これをVP3遺伝子に連結し、カイコ培養細胞を使用して組換え多角体を生産した。この多角体を用いて、ホウレンソウ葉緑体の粗抽出液からTrx-mと相互作用するタンパク質のいくつか(Rubisco Activaseなど)を分離することに成功した。具体的には、多角体をDTTで前処理して洗浄し、次にタンパク質と反応させ、最後にDTT処理して多角体から溶出させることで相互作用するタンパク質の分離を行うことができた。この洗浄方法や特異性の高さ、繰り返し利用性のなどについては今後も検討を続け、洗練された方法とする価値があると考えられた。

植物の貯蔵器官を対象とした簡易な培養装置を開発することによって、新たな種苗生産体制の構築をめざした。モデル植物として主にサトイモを用いた。まず、サトイモの大量培養条件を明らかにした。大量培養装置開発に関して、特に強制通気の問題点に注目した。すなわち、強制通気は成育を促進する反面、培養装置の構造や培養の管理作業を複雑化させる。また、植物器官は一般に酸素消費速度が遅いため、強制通気によって酸素供給量を確保する必要がない可能性があった。そこで、実際に、サトイモを液体培地中に沈めた状態で静置培養し、このような酸素供給が制限される条件下でも成育可能であることを確かめた。次に、回転ドラム型培養装置を利用し、強制通気を行わないで大量培養する培養装置を試作した。この培養装置内では、培養物は、培地中に没したり気相中に露出したりすることを繰り返す。この装置を用いて、サトイモ植物体が良好に生育することを確かめた。また、同じ原理でさらに簡易な培養装置を試作し、かつ、培養形態が全く異なる材料のモデルとしてジャガイモを用いて培養した結果、やはり良好な塊茎形成が観察された。本研究の培養条件下で得られたサトイモ植物体の貯蔵物質含量を測定した結果、球茎(貯蔵器官)としては未成熟と考えられた。植物体は、培養後は直ちに順化する必要があった。順化は容易であったが、発根が弱く長期栽培中に枯死する株が目立った。この問題に対し、水、あるいは、ある種の抗酸化剤の水溶液中で短期間培養することによって、発根を促進できることがわかった。以上の研究結果を総合し、簡易培養装置を利用した大量培養を中心とする種苗生産体制を構築する可能性が示唆された。

1.器官培養用の培養装置の開発実験材料として、ベラドンナの不定根を用いた。ドラム型培養装置、および、通気撹拌型培養槽を用いて、ベラドンナ不定根培養系に適した装置の試作を試みた。まず、気相中に不定根を保持し培地を霧状にして供給する方法を試みたが、安定して培養でき、かつ、培養条件を容易に制御できるような実験用装置の構築は困難であった。種々の検討の結果、ドラム型培養槽内に金網などメッシュ状の内筒を設置し、これに、分化した器官を捕捉させるようにして培養する方法が、本研究目的に最も近い形と考えられた。この方法では、培養中に、金網や金網表面に張り付けた多孔質担体(大孔径のスポンジ等)に自動的に植物器官が付着した。培地量や回転数を変化させれば、培地中への浸漬時間やそのタイミングを制御することが可能である。また、通気撹拌型培養槽の撹拌軸に金網からなるカゴを固定し、これに不定根を付着させ培養する方法について、現在、検討を行っている。2.実験に適した培養系の開発実験に用いた培養系は、きわめて安定に分化することが確かめられている。ここから、全く同じく条件下でも分化せず、かつ液体振とう培養可能な細胞を分離し、増殖させることに成功した。さらに、この脱分化細胞を分離する過程で、一旦は脱分化するものの、全く同じ培地条件で継代すると分化し始める株が確認された。このように、「分化」という現象に関連した生化学的な変化を解析するうえで、有用な培養系が得られた。しかし、培養槽を用いてこれらの系を培養することに関しては、特に最後に述べた培養系の維持が困難であり、詳細な条件検討を進めている。3.環境条件の変化に対する反応さらに、活性酸素に関連する物質の影響について検討する予定であったが、これについては、実施に至らなかった。