The diverse functions of gut symbiotic bacteria are attracting attention for their potential as probiotics. Some of those bacteria release extracellular vesicles (EVs), spherical structures of approximately 20–400 nm in diameter, outside their cell bodies. Recent research has significantly advanced our understanding of the physicochemical and biochemical properties, functions, and host–cell interactions of EVs released by probiotic bacteria used in food fermentation, such as lactic acid bacteria, bifidobacteria, butyric acid bacteria, and acetic acid bacteria. However, concerns have been raised regarding the use of these EVs as postbiotics. In this review, we discuss the newly discovered roles of EVs in the gut immune signaling and the challenges associated with their application as postbiotics.

ABSTRACT We characterized the membrane vesicle fraction (RD-MV fraction) from bacterial strain RD055328, which is related to members of the genus Companilactobacillus and Lactiplantibacillus plantarum. RD-MVs and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) were detected in the RD-MV fraction. Immunoglobulin A (IgA) was produced by Peyer's patch cells following the addition of the RD-MV fraction. In the presence of the RD-MV fraction, RAW264 cells produced the pro-inflammatory cytokine IL-6. Recombinant GAPDH probably induced the production of IL-6 by RAW264 cells via superficial toll-like receptor 2 (TLR2) recognition. A confocal laser scanning microscopy image analysis indicated that RD-MVs and GAPDH were taken up by RAW264 cells. GAPDH wrapped around RAW264 cells. We suggest that GAPDH from strain RD055328 enhanced the production of IgA by acquired immune cells via the production of IL-6 by innate immune cells through TLR2 signal transduction.

Immunoglobulin A (IgA) is involved in the maintenance of gut homeostasis. Although the oral administration of bifidobacteria increases the amount of fecal IgA, the effects of bifidobacteria on intestinal immunity remain unclear. We found and characterized membrane vesicles (MVs) derived from Bifidobacterium longum subsp. infantis toward host immune cells. Bifidobacterium infantis MVs consisted of a cytoplasmic membrane, and extracellular solute-binding protein (ESBP) was specifically detected. In the presence of B. infantis MVs or recombinant ESBP, RAW264 cells produced the pro-inflammatory cytokine IL-6. IgA was produced by Peyer's patches cells following the addition of B. infantis MVs. Therefore, ESBP of B. infantis MVs is involved in the production of IgA by acquired immune cells via the production of IL-6 by innate immune cells.

We investigated the characteristics and functionalities of extracellular vesicles (EVs) from Lactiplantibacillus plantarum (previously Lactobacillus plantarum) towards host immune cells. L. plantarum produces EVs that have a cytoplasmic membrane and contain cytoplasmic metabolites, membrane and cytoplasmic proteins, and small RNAs, but not bacterial cell wall components, namely, lipoteichoic acid and peptidoglycan. In the presence of L. plantarum EVs, Raw264 cells inducibly produced the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, the anti-inflammatory cytokine IL-10, and IF-γ and IL-12, which are involved in the differentiation of naive T-helper cells into T-helper type 1 cells. IgA was produced by PP cells following the addition of EVs. Therefore, L. plantarum EVs activated innate and acquired immune responses. L. plantarum EVs are recognized by Toll-like receptor 2 (TLR2), which activates NF-κB, but not by other TLRs or NOD-like receptors. N-acylated peptides from lipoprotein19180 (Lp19180) in L. plantarum EVs were identified as novel TLR2 ligands. Therefore, L. plantarum induces an immunostimulation though the TLR2 recognition of the N-acylated amino acid moiety of Lp19180 in EVs. Additionally, we detected a large amount of EVs in the rat gastrointestinal tract for the first time, suggesting that EVs released by probiotics function as a modulator of intestinal immunity.

Isoamyl alcohol (i-AmOH) is produced from α-ketoisocaproate in the l-leucine biosynthetic pathway in yeast and controlled by the negative feedback regulation of α-isopropylmalate synthase (IPMS), which senses the accumulation of l-leucine. It is known that i-AmOH production increases when mutations in the regulatory domain reduce the susceptibility to feedback inhibition. However, the impact of mutations in this domain on the IPMS activity has not been examined. In this study, we obtained 5 IPMS mutants, encoding the LEU4 gene, N515D/S520P/S542F/A551D/A551V, that are tolerant to 5,5,5-trifluoro-dl-leucine. All mutant proteins were purified and examined for both IPMS activity and negative feedback activity by in vitro experiments. The results showed that not only the negative-feedback regulation by l-leucine was almost lost in all mutants, but also the IPMS activity was greatly decreased and the difference in IPMS activity among Leu4 mutants in the presence of l-leucine was significantly correlated with i-AmOH production.

A novel consecutive enzymatic conversion was developed for production of caffeic acid phenethyl ester analogues from unused coffee beans. The procedure was comprised of chlorogenate hydrolase and Novozyme435 with [BMIM][NTf2] as the solvent. The analogues exhibited strong antiproliferative activities toward various human tumor cells.

【目的】イオン液体はアニオンとカチオンから構成され、常温常圧で液体の塩である。アニオンとカチオンの組み合わせにより疎水性や親水性を示すイオン液体を調製可能であり、疎水性や親水性を示す化合物を溶解できる。さらに不揮発性や難燃性、熱安定性を示す。イオン液体は優れた反応溶媒であり、イオン液体中で利用可能な酵素の取得が期待される。本研究では親水性・疎水性イオン液体存在下で生育する微生物を探索し、酵素活性の検出を試みた。 【方法・結果】まず天日塩や岩塩、醤油もろみ、キムチ、くさや漬け汁から、耐塩性細菌の獲得を試みた結果、20% NaClを含む培地で生育する6種類の細菌群集を得た。続いてイオン液体を含む培地で生育を検討した結果、くさや漬け汁とキムチ由来の細菌群集はそれぞれ疎水性イオン液体[BMIM][PF6]と親水性イオン液体[EMIM][CF3SO3]を含む培地で生育した。[EMIM][CF3SO3]を含む培養液上清からアルカリフォスファターゼとエステラーゼ活

【目的】 Octyl gallateは高い抗菌、抗ウイルス活性を有するが、不溶性であるため扱いにくい。そこで、Octyl gallateの溶解度を高めるため、Ethyl gallateから２段階の酵素反応でOctyl gallate配糖体を酵素合成する方法を開発した。 【方法および結果】 Octyl gallateを直接配糖化する糖転移酵素を探索したが、見つけることができなかった。そこで、基質をEthyl gallate に変えて配糖化酵素を探索した結果、Sucrose phosphorylaseがEthyl gallate-4-O-α-glucopyranosideに変換することを見出した。得られたEthyl gallate-4-O-α-glucopyranosideと1-Octanolから、イオン液体中でOctyl gallate配糖体に変換できるリパーゼを探索したところ、Lipozyme RMIM反応液から新規ピークを検出した。この生成物を単離し、機器分析からOctyl gallate-4-O-α-glucopyranosideと同定した。供試イオン液体中では、[BMIM][NTf2]が最適（変換率40％）で、親水性イオン液体より疎水性イオン液体中で高い活性を示した。Octyl gallate配糖体はPseudomonas aeruginosaとBacillus subtilis

【目的】Methyl dicaffeoyl quinate (DCQA-Me) は、プロポリスなどに微量含まれ、DPPHラジカル消去作用、抗がん活性など多様な生理活性をもっている。そこで、コーヒー生豆から抽出した 5-Caffeoyl quinic acid（5-CQA）を出発物質とし、イオン液体（IL）中で二段階の酵素反応でDCQA-Meに変換する方法を開発した。 【方法および結果】まず、5-CQAとメタノールから5-CQA-Meを合成する IL と酵素を探索した。その結果、[Bmim] [NTf2]に5-CQAとメタノールを溶解し、Novozyme 435を40℃で 96 h 反応させると、5-CQA-Meを得ることができた（モル変換率93％）。次に、5-CQA-Meとvinyl caffeateからDCQA-Meに変換できる酵素を探索した結果、Lipozyme TLIM反応液から新規ピークを検出した。単離した生成物は、機器分析から4,5-DCQA-Meと同定した。本酵素は疎水性 IL中ではDCQA-Meを合成したが、親水性ILやt-butyl methyl etherやdioxaneなどの有機溶媒中では合成しなかった。また、疎水性ILに溶解した5-CQA-Meは基質として利用したが、溶解しなかった5-CQA

【目的】本研究室では市販チーズから単離した酵母 Candida maltosa NP9 が揮発性酢酸イソアミル（IA）を生産し、Aspergillus niger 胞子の発芽を阻害することを報告した1)。本研究では、揮発性 IA の抗菌抗真菌スペクトルを評価するとともに、IA 曝露で生じた E.coli 細胞の構造変化を電子顕微鏡で観察し、2D-DIGEを用いたプロテオーム解析をおこなった。 【方法・結果】vapor-agar contact 法で抗菌スペクトルを試験した結果、IA は供試糸状菌 15 種、酵母 5 種、グラム陽性菌 7 種、陰性菌 2 種全ての生育を阻害した。また、IA は A.niger 胞子の発芽を静菌的に阻害したが、 E.coli と Saccharomyces cerevisiae の生育は殺菌的に阻害した。IA に曝露した菌体を TEM 観察すると、E.coli では細胞内の構造に変化が認められ、S.cerevisiae では細胞内小器官の崩壊が観察された。また、E.coli 抽出タンパク質の 2D-DIGE では、発現の異なるタンパク質スポットが複数確認できた。 １）小俣ら：日本農芸化学会 2010 年度大会講演要

くさや漬け汁とキムチから10%[EMIM]{CF3SO3]存在下で生育する微生物3株とキムチから5～40％[BMIM][PF6]存在下で生育する微生物5株を分離することに成功した。

5-カフェオイルキナ酸をイオン液体中で酵素を用いてキナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化した。得られたカフェオイルキナ酸メチルエステルトカフェ酸ビニルエステルからイオン液体中で酵素を用いて4,5-ジカフェオイルキナ酸メチルエステルを酵素合成することに成功した。

sucrose phosphorylase を用いて ethyl gallate を ethyl gallate-4-O-α-glucopyranosideに変換した。次にイオン液体中でethyl gallate-4-O-α-glucopyranosideと1-octanolからLipozyme RMIMを用いて octyl gallate-4-O-α-glucopyranosideに変換できた。octyl gallate-4-O-α-glucopyranosideをα-glucosidaseで処理すると、octyl gallateが生成し、広い抗菌スぺクトルを示した。

細菌が細胞外に放出する膜小胞は、生体の免疫系を賦活化できるため、ワクチンアジュバントへの応用が期待される。しかし膜小胞でどのような免疫応答を増強できるのか不明であり、膜小胞による生体への作用機序も不明である。膜小胞の生産機構は不明であり、免疫賦活能に優れた膜小胞の高生産株は育種されていない。膜小胞の活用には、これらの点を解明する必要がある。 すでに発酵食品や腸から独自に分離した細菌の膜小胞に、IgAやIgGという抗体の生産量を増加できるアジュバント活性を発見し、膜小胞による免疫細胞への作用機序を解明しつつある。そこで新たなアジュバント開発を目的として、独自の膜小胞を対象に①抗体の産生誘導活性を担う物質の同定、②膜小胞に対する腸管細胞層の応答や透過性の解明、③細菌による膜小胞の形成・分泌機構の解明を行う。 R3年度には、乳酸菌やビフィズス菌を対象に、膜小胞中の抗体産生誘導能を示す物質の同定を試みた。具体的には、（１）Lactiplantibacillus属細菌、Bifidobacterium属細菌の膜小胞による、炎症性サイトカインや抗炎症性サイトカインの産生誘導能、抗体IgAの産生誘導能を検出できた。（２）Lactiplantibacillus属細菌の膜小胞中のタンパク質を網羅的に同定し、リポタンパク質Lp19180を見いだした。（３）リポタンパク質Lp19180は、異種発現系で発現させて、各種カラムワークで精製した。精製したリポタンパク質Lp19180を用いて、Toll様受容体2を介したNF-κBの活性化、サイトカインの生産誘導能を確認できた。また、Lactiplantibacillus属細菌、Bifidobacterium属細菌の膜小胞中のタンパク質に注目して、抗体を作成して、膜小胞の検出系の構築を試みた。

Skin microbiota is concerned in several diseases and healthy condition, we thus focus on Staphylococcus aureus and S. epidermidis. Aeromonas hydrophila converted 9cis-C18:1 to 7cis-C16:1 and 5cis-C14:1. 7cis-C16:1 showed selective anti-bacterial activity which suppressed growth of S. aureus and did not suppress growth of S. epidermidis. So, we attempted purification of 7cis-C16:1. Purification of 7cis-C16:1 was not succeeded through enzymatic process, but ODS column was effective for purification of 7cis-C16:1 (86% purity).

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