Telomerase activity has been regarded as a critical step in cellular immortalization and carcinogenesis and because of this, regulation of telomerase represents an attractive target for anti-tumor specific therapeutics. Recently, one avenue of cancer research focuses on antisense strategy to target the oncogenes or cancer driver genes, in a sequence specific fashion to down-regulate the expression of the target gene. The protein catalytic subunit, human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and the template RNA component (hTERC) are essential for telomerase function, thus theoretically, inhibition of telomerase activity can be achieved by interfering with either the gene expression of hTERT or the hTERC of the telomerase enzymatic complex. The present study showed that phosphorothioate antisense oligonucleotide (sASO)-nuclear localization signal (NLS) peptide conjugates targeting hTERC could inhibit telomerase activity very efficiently at 5 μM concentration but less efficiently at 1 μM concentration. On the other hand, siRNA targeting hTERT mRNA could strongly suppress hTERT expression at 200 nM concentration. It was also revealed that siRNA targeting hTERT could induce telomere attrition and then irreversible arrest of proliferation of cancer cells.

Resveratrol, a phytoalexin present in grapes and other edible foods, has been reported to have beneficial effects against various diseases including cancer. We previously reported that resveratrol and its derivative, caffeic acid-adducted resveratrol, selectively inhibit the three-dimensional (3D) proliferation of a human colorectal cancer cell line, HCT116 with activating KRAS mutation. Herein, we demonstrated that a novel compound, ferulic acid-bound resveratrol, also represses the 3D proliferation of HCT116 cells. We observed that resveratrol conjugated to two ferulic acids represses the 3D proliferation of HCT116 cells more strongly than resveratrol and resveratrol conjugated to one ferulic acid. Resveratrol conjugated to two ferulic acids also inhibited the 3D proliferation of MCF7 human breast cancer cells. We further uncovered that the resveratrol derivative increases the mRNA level of the tumor suppressor p15, a CDK inhibitor that functions as a brake of cell proliferation in HCT116 cells. These results imply that the resveratrol derivative represses 3D proliferation via increasing p15 expression in HCT116 cells.

BACKGROUND/AIM: ANRIL is a long noncoding RNA located on INK4 locus, which encodes p15 and p16 that cause G1 phase arrest in the cell cycle. ANRIL positively regulates proliferation of several kinds of cancer cells such as lung and gastric cancers. This study, examined the effect of ANRIL in head and neck squamous cell carcinoma cells. MATERIALS AND METHODS: Cells were transfected with siRNA oligonucleotides targeting ANRIL. Transfected cells were subjected to cell-cycle and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis. RESULTS: Depletion of ANRIL increased p15 mRNA in FaDu cells, and p15 and p16 mRNA in CAL27 cells and inhibited proliferation of these cells. Cell cycle analysis showed that depletion of ANRIL caused arrest at the G1 phase of the cell cycle. CONCLUSION: ANRIL promotes G1 phase progression by repressing p15 and p16, and thus promotes FaDu and CAL27 cell proliferation.

〈Abstract〉KRAS mutation is positive in 45% of colon cancer patients, 35% of lung cancer patients, 95% of pancreas cancer patients, and 15% of melanoma patients and the patients do not benefit from anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) chemotherapy and antibody therapy to have poor prognosis for survival. KRAS mutations in codons 12 and 13 were present approximately in 40% of colorectal cancers. It is highly challenging to target mutant KRAS gene by synthetic small nucleic acids and can be a breakthrough for undruggable cancers.In the present study, we investigated silencing efficiencies of mutant KRAS(G12D) gene by gapmer antisense oligonucleotides (ASO) using HeLa with wild type KRAS and PK-45H with G12D mutation in both alleles. ASOs targeting mutant KRAS (G12D) with 11nt and 9nt phosphorothioate gap silenced KRAS(G12D) expression in 81% and 73% efficiency in PK-45H, respectively but affected very little on the wild type KRAS expression in HeLa.

Small interfering RNA (siRNA) induces RNA interference by forming RNA induced silencing complex (RISC). From a therapeutic point of view, chemical modifications and conjugations of siRNA are powerful strategies to improve their properties toward clinical applications. We can access to siRNA molecules from hydroxyl groups, phosphate backbone, and major groove side and minor groove side of nucleobases. We need to know proper moieties at proper positions for chemical modifications to construct an optimized structure of siRNA. In the present study, we synthesized and evaluated 10 types of siRNAs bearing C5-modified T. All the siRNAs modified in the antisense strand showed reduced silencing efficiencies. It is to be noted the modified positions which intensively reduced silencing efficiencies are well consistent with the positions having major kinks and turns in the crystal structure of guide strandim & Ago2. On the other hand, modification of the sense strand caused less damage to silencing of siRNA and no damage was observed for the modification at s8.

For clinical applications of small interfering RNA (siRNA), chemical structure of siRNA should be optimized to be taken up into cells effectively, resistant to nuclease digestion, incorporated into RNA induced silencing complex (RISC) rapidly and correctly. They should also have minimized off-target effect and maximized turn over number. In this study, we investigated RNA interference (RNAi) efficiencies of siRNAs bearing 5'-amino-5'-deoxythymidine (T*) at 5'-end. The results showed that T* at the 5'-end of the sense strand did not interfere the processes of RISC loading complex (RLC) formation, loading to RISC or cleavage of the passenger strand by human argonaute2 (hAgo2) at all. On the other hand, T* at the 5'-end of the antisense strand gave a fatal damage to siRNA to show almost no silencing effect probably because RISC was destabilized by an electrostatic repulsion between the cationic charge of the ammonium group of T* and the cationic residues in MID domain pocket of hAgo2. These results strongly suggest that a modification of 5'-end of a sense strand with T* will suppress an off-target effect.

本研究では、変異KRAS制御シグナルにより、制御される微小環境、及び、癌分子機構を解明し、微小環境の構築を阻害する物質を同定することを試みた。まず、HCT116ヒト大腸癌細胞より変異型KRASを欠失させたHKe3細胞に再度、野生型または変異型KRASを強制発現させた、遺伝的背景が均一な細胞を用いた3次元浮遊培養システムを樹立した。このシステムを使用し、約400種天然物由来化合物のスクリーニングを行い、変異KRAS特異的に細胞塊の縮小をきたす8個のコア化合物を取得した。さらに、これらの派生化合物121個を「変異KRAS関連シグナル阻害用組成物」として、特許申請した。

INK4遺伝子座は、癌抑制遺伝子p15/p16/ARFをコードしており、ヒトの癌の30-40%で変異が見つかっていることから、癌抑制において重要な領域と考えられている。しかし、この領域の発現制御機構はほとんど明らかとされていない。本研究により、INK4遺伝子座が、ポリコームタンパク質、p53及び長鎖ノンコーディングRNAによって、統合的に転写制御されていることが明らかとなった。

近年の大規模なトランスクリプトーム解析の結果、ゲノムの大部分の領域が転写されていること、その大半がタンパク質をコードしないノンコーディングRNA(ncRNA)であることが明らかとなった。ncRNAの中で最大の構成員をもつものはmRNAと同じような遺伝子構造をもつ長鎖ncRNAであるが、その機能はほとんど謎である。そこで本研究課題では、長鎖ncRNAの機能及び作用マシナリーの解明を目的とした。本年度の研究により、長鎖ncRNAであるANRIL(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus)が、細胞老化を抑制していることを明らかとした。さらにその作用マシナリーとして、ANRILはクロマチンサイレンシングに関与するポリコームタンパクと結合し、INK4遺伝子座へのポリコームタンパクリクルートメントを促進することを明らかとした。また、高解像度タイリングアレイ解析により、細胞周期制御遺伝子群(56個)の近隣に存在する216個の長鎖ncRNAを同定した。その中で、DNA損傷シグナルによって発現誘導される新規長鎖ncRNA、PANDA(p21 associated ncRNA DNA damage activated)がアポトーシスを抑制する機能を持つことを明らかとした。その作用マシナリーとして、PANDAは転写因子NF-YAと結合し、アポトーシス促進遺伝子群プロモーター上へのNF-YA結合を阻害することによって、アポトーシス促進遺伝子群の転写を抑制していることを明らかとした。

生殖細胞のなかでも、オスの精子幹細胞は唯一in vitroで増殖することができるほど自己複製能が高く、非常に安定に精子形成を支えることが知られている。しかし、「種の保存」という重大の役割を担うために必須であるこの自己複製がどのように制御されているのか、その機構は明らかとされていない。近年、造血幹細胞や神経幹細胞の自己複製に、ポリコームタンパクが関与していることが報告された。我々は精子幹細胞の自己複製にもポリコームタンパクが関与しているのではないかと考え、ポリコームタンパクによる精子幹細胞の自己複製(増殖)制御機構の解明及び標的遺伝子を同定することを目的とした。本年度の研究により、我々は正常ヒト胎児線維芽細胞を用いて、長鎖ノンコーディングRNAであるANRILが細胞増殖に重要な役割を果たすINK4遺伝子座の転写を抑制することを明らかとした。そのメカニズムとして、1)ANRILはポリコームタンパクと結合すること、2)ANRILはINK4遺伝子座へのポリコームリクルートメントを促進することを明らかとした。さらにANRILは、細胞老化を抑制することを見出した。また,p53がポリコームタンパクをINK4遺伝子座内にあるARF遺伝子のプロモータ上にリクルートすることを明らかとした。これらの結果から、ポリコームタンパクは精子幹細胞においても、長鎖ノンコーディングRNAやp53を介してINK4遺伝子座を抑制することにより、増殖を正に制御している可能性が考えられた。