The psychrophilic, moderately piezophilic bacterium Shewanella violacea strain DSS12 is a deep-sea isolate from a sediment sample collected at the Ryukyu Trench (depth: 5,110 m), which grows optimally at 30 MPa and 8°C but also grows at atmospheric pressure (0.1 MPa) and 8°C. We have examined this strain to elucidate the molecular basis for gene and protein regulations at different pressure conditions because this strain is useful as a model bacterium for comparing the various features of bacterial physiology under pressure conditions. Proteins, from such deep-sea adapted piezophiles, could be active under high-pressure conditions in general. Actually atmospheric pressure adapted proteins can be inactive under higher-pressure conditions. For bio-processing under pressure, people are looking for pressure-tolerant enzymes, thus, “piezophilic proteins” would be focus on such industrial applications. In the case of respiratory proteins, cell divisional protein FtsZ, RNA polymerase subunit structure, and dihydrofolate reductase (DHFR), piezophilic proteins were unique for adaptation to high-pressure environment and some of them were more stable and active under higher pressure conditions.

The method of electrophoretic mobility shift assay under high-pressure conditions was improved using a high-pressure electrophoresis apparatus with capillary narrow-tube gel. It was found that the protein–DNA complex in the gel was stained as a high-resolution spot with ethidium bromide. Using this method, it was found that the behavior under high-pressure conditions of the protein–DNA complex composed of NtrC protein and its target promoter DNA is important for the pressure-regulated transcription process, and it was confirmed that the complex was dissociated above a pressure of 70 MPa.

RNA polymerase from cells of the deep-sea bacterium Shewanella violacea DSS12 was purified using three chromatographic steps. An in vitro transcription assay indicated that the purified enzyme was σ⁷⁰ containing RNA polymerase. The enzyme activity was inhibited in the presence of rifampicin when the sensitive domain was targeted. The rpoBC genes encoding for the β and β′ subunits of RNA polymerase were cloned and their nucleotide sequences determined. Expression plasmids, designated pQSVB and pQSVC, to overproduce these proteins were constructed, and the proteins were purified using a Ni²⁺ affinity column. In vitro reconstitution using all proteins for the holoenzyme (α, β, β′, σ⁷⁰) was carried out and the activity of the recombinant RNA polymerase was detected.

NtrC protein of piezophilic Shewanella violacea was overexpressed and purified, to confirm the protein-DNA interaction. An electrophoretic mobility shift assay demonstrated that the NtrC recognizes the sequence for NtrC binding within the region upstream of the glnA operon. Western blot analysis also showed that the NtrC is expressed at a higher level under high-pressure conditions than under atmospheric pressure conditions.

The primary structure of the chicken ribosomal protein L30 was deduced from the sequence of nucleotide in a recombinant cDNA. Chicken ribosomal protein L30 has 115 amino acids and a molecular weight of 12,814 including initiator methionine. Hybridization of the cCDNA to the restriction enzyme digests of chicken liver DNA suggests that L30 gene is a single copy. Chicken L30 is homologous to ribosomal proteins from other eukaryotes and archaebacteria but not to those from eubacteria.

平成15年度文部科学省サイエンス・パートナーシッププログラム採択事業についての研究成果を報告した。 動機付け教育として実験、実習が効果的であり、生徒・学生の学習活動が継続的に行なわれれば、自学自習によって高度な教育が可能であることが示唆された。同時に実験・実習内容の精査やプログラム以前での実験技術に拘わる事前実習やティーティングアシスタントの養成が重要であることを指摘した。

窒素固定菌Paenibacillus azotofixansのニトロゲナーゼ鉄タンパク質をコードする遺伝子nifHを含む2つのオペロンのクローニングを行い、塩基配列の決定によりそれら遺伝子群の構造を明らかにした。

全ゲノム解析が進行している深海微生物 Shewanella violacea のリボソーム関連遺伝子群の構造解析を行い、 報告した。

高度好塩古細菌 Haloarcula japonica の 16SrDNA のコピー数と多型性に関する系統解析を行い、 Haloarcula 属の進化について考察した。

深海微生物 Shewanella violacea の全ゲノム解析による応用の可能性について、 特に環境修復技術開発の観点から論じた。

窒素固定菌 Paenibacillus azotofixans （IFO16645） のニトロゲナーゼ鉄タンパク質をコードする遺伝子 niflt を含む 2 つのオペロンのクローニングを行い、 それら遺伝子群の構造を明らかにした。

高圧下における転写メカニズムを明らかにする目的で、深海由来好圧性細菌より転写酵素 RNA ポリメラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、それらを試験管内にて蛋白合成を行い、本酵素の再構成を試み、それに成功した。

泡盛の香味成分であるバニリンは、原料米のフェルラ酸がフェノール酸脱炭酸酵素により4-ビニルグアヤコール (4-VG)へ変換された後、バニリンへ変化する。熟成3年後の泡盛古酒は、このバニリン濃度の高さを特徴とする。本研究では、香り高い(バニリン香)泡盛の製造法を提案した。泡盛は黒麹菌及び泡盛酵母の協働により発酵が進行する。本研究では、この芳香に関与する酵素（padC）を黒麹菌に見いだし、その機能を評価し、本酵素の潜在性を引き出すことで、バニリン香が強化された泡盛の製造が実現可能な研究を行い、通常よりも短期間に古酒の特性の付加を可能にし、熟成の効率化を導く提案を行った。

本研究においては、全ゲノム解析が終了した好圧好冷性細菌Shewaneila violacea DSSI2株ゲノム情報から情報学的解析により有用遺伝子候補の抽出を行い、応用化に向けた機能解析を行うことを本研究の目的とした。 全ゲノム配列情報から、プロモーター配列情報を効率的に検索・抽出し、整理が可能なソフトウェアの構築を試み、本プログラムをDSS12株ゲノムに適用しその解析を行った。本プログラムのプロモーター候補検索の基本的原理は以下の通りである。1)アノテーション済みのゲノム配列データを読み込む、2)解析者が検索したい目的配列を指定し検索する、3)検索された配列は分類、位置情報、ゲノム上のマッピングを行う。現在これら解析データは整理中であり、終了後に上記データベース情報と共に公開される予定である。ゲノム機能解析の一環として、本菌株の有する3種のアルカリフォスファターゼに着目し酵素の活性測定を行った。発現ベクターの構築の後、精製蛋白を用い、各々酵素活性を測定したところ、3種とも、低温から高温まで、温度に関して異なる活性を有していることが明らかとなった。現在、これら酵素のさらなる有用性を検討するため、温度、塩濃度、pH等に対する安定性に関して解析を行っている。さらにその他の酵素についても同様な解析を進めている。さらに独立行政法人海洋研究開発機構が主宰する、しんかい6500による深海調査に参加し、日本海深海底泥をサンプリングした。その底泥から、低温プロテアーゼ、アミラーゼ、窒素固定能を有する、新規有用深海微生物分離を試み、何種類かの微生物の分離が行われた。これら微生物の多くは、耐冷性、又は好冷性を有し、16SrDNAによる系統解析を行ったところ、数種は新種である可能性が示唆された。特に窒素固定細菌については、これまでまた深海環境からの分離例はなく、現在、これら微生物の有用性を探るべく、詳細な生理学及び分類を行っている。

本調査研究は、タイ国チャオプラヤ水系に展開する水辺集落(筏住居・杭上住居)における伝統的な環境共生様式と近代化変容の実態を明らかにするとともに、その住居改善方策を検討することを目的としている。 平成13年度は、タイのピサヌローク(バンコク北498km)を対象地域として、そこに存在する筏住居について、集落と住宅の様態、および居住実態を把握した。集落構成では、5年間で約62%のフローティング・ハウスが減少していた。水上住宅の形態につては、生活水に川の水を利用し、その水を生活廃水として川にそのまま流している。壁は板張りで、川側は格子になっていることが多く、壁の上部も格子になっている。窓にはガラスが無く、木の扉で常に開放してある。居住実態につては、住宅内にはテレビなどの電気製品が充実しており、伝統的な生活から近代的な生活に移りつつある。日常使っている水の大半は、川の水を利用しており、川に頼っている世帯が多く見られた。陸上生活を望んでいる世帯は半数以上あり、行政の護岸工事による強制移動や筏に使っている竹の価格上昇による住宅維持の困難、モータリーゼーンションの変化などの要因があげられる。 平成14年度は、タイのバンコクを対象地域として、そこに存在する水上住宅について、集落と住宅の様態、および居住者の居住実態を把握することを主眼としている。生活用水は水道水と運河の水を利用し、生活排水はそのまま運河に垂れ流しにしている。水上住宅の特徴としては壁は板張りで、台所やトイレの壁はトタンを打ち付けている住宅が多い。窓は、ガラスの入った扉が取り付けられており、普段は開放されている。住宅内にはテレビやオーディオなどの電化製品が充実しており、伝統的な生活から近代的な生活に移りつつある。日常使っている水は水道水と運河の水を利用している。外出する際の交通手段は、バイクや自動車、自転車などの陸上交通を利用している世帯もあるが、ボートを利用している世帯もあり、未だに伝統的な水上交通が利用されている。周辺の環境が良く、多くの世帯が移住を望んでいない。 平成15年度は、タイのピサヌロークを対象地域として、筏住宅から陸上住宅に移住した居住者を追跡調査し、住宅形態・居住実態を把握すること、である。筏住宅から陸上住宅に移住したことによって、急激に近代的な生活にシフトし、適応して、生活や住環境は向上し、満足そうにしている。筏住宅から移住する時に、解体したものを持ってきて、仕事場や玄関前の休憩スペース、台所といったとこに再利用しており、愛着やこだわり等を見ることができ、近代的住宅に伝統的住宅の面影を見ることができる。

光触媒の抗菌作用については多くの研究例が報告されているが,いずれも光触媒を機能させるためには紫外線しか利用できないので,抗菌作用について紫外線の効果と光触媒の効果とを区別して議論することは不可能であった。本研究では我々のグループが開発した可視光応答性酸化チタン光触媒を用いることにより,上記の問題点の解決を図った。検討項目は以下の3項目である。 (1)微生物の影響を調査するのに好ましい光触媒の薄膜化 (2)原核微生物として大腸菌を対象に可視光-光触媒の効果を確認 (3)真核微生物として酵母を対象に可視光-光触媒の効果を確認 (1)については,ゾルゲル法をベースとする方法で可視光応答性酸化チタン光触媒の薄膜化に成功した。具体的には,硫酸チタンを原料としてアンモニアで加水分解後,過酸化水素を加えて加水分解物を解コウして得た過酸化チタン前駆体ゾルを得た。薄膜は前駆体ゾルにアンモニアを加え,パイレックスガラス基材表面にスピンコーターでコーティングし,乾燥後,350℃の温度で1時間焼成することで成膜した。(特許出願) (2)可視光応答型酸化チタン光触媒をコーティングしたパイレックスガラス基材表面に大腸菌(E.coli from)を含む水滴を滴下し,4℃で水分が蒸発しない条件で青色および緑色LEDを照射し,光照射による影響を生菌数によって評価した。その結果,LEDを照射した場合のcell numberは,青色LEDでは0.12×10^2,緑色LEDでは0.23×10^2,と光を照射しないときの4.13×10^2と比較すると明らかに減少し,光触媒の効果が確認された。(3)酵母を対象に(2)と同様の実験を行ったところ,光触媒の効果はほとんど見られなかったことから,光触媒の作用は原核細胞には有効であるが,真核細胞には効果は薄いことが示唆された。