It is well known that the survivability of gametes of postmortem carcass was decreased as time passes after death. In this study, it was examined whether cytoplasmic replacement rescues the survivability of germinal vesicle stage (GV) oocytes of postmortem carcass in the mouse. Reactive oxygen species (ROS) levels and mitochondria numbers in GV oocytes of the dead mice stored at 4 degrees were significantly impaired after 44 h postmortem compared to the control (0h). However, when kayoplasts of GV oocytes of postmortem carcass was transferred to recipient ooplasts (GV transfer), proportion of in vitro maturation (IVM), normal spindle morphology, in vitro and in vivo developmental ability after IVF of reconstituted oocytes was improved. Moreover, secondary follicle oocytes of postmortem carcass were developed, matured and fertilized in vitro and developed to go to term, when GV transfer was conducted at the GV phase. Thus, transfer of GV karyoplast recovered from postmortem carcass, which viability was decreased, into fresh GV recipient ooplasm, rescues survivability of reconstituted oocytes. It suggested the effective use of oocytes of dead animals in the mouse and this achievement must apply to other rare animal species, especially animals under control by human.

体細胞を核移植した時に生じる核の初期化機構を中心に紹介した。

1952年以降ヒョウガエルやツメガエルを用いて行われてきた実験から，オタマジャクシの小腸細胞のような分化した体細胞の核移植によって正常なカエルが得られることが示されている．しかしながら，成体のカエルの体細胞からはオタマジャクシは得られるが，正常なカエルは得られていない．今回Wilmutら[1]は，少なくとも一部の成体の体細胞核は個体への発生能力を維持していることを動物で初めて示した．本稿では，これまでの研究の歩みをふりかえりながら，哺乳動物における体細胞核移植の意義と将来の研究方向を展望してみたい．

In the present study, the pluripotency of embryonic cells on the germ line, especially fetal germ cells, was examined. The results obtained are as follows; when donor cells on the germ line were aggregated with precompacted stage embryos or injected into blastocysts, fertile chimeric mice or fetuses were obtained from 3.5, 4.5 and 5.5 days cells and ES-cells, respectively. However, further stage cells never contributed to the conceptuses even though analyzed at 10.5 days of pregnancy. When fetal germ cells on days 14.5-16.5 were reprogrammed by fusion with enucleated oocytes and then treated with fertilized embryos, they can form chimeric fetuses and extraembryonic tissues. It was suggested that differentiated cells on the germ line such as fetal germ cells can also develop to chimeric fetuses after reprogramming. However, it was also clear that they died at the midgestation probably due to the inappropriate imprinting.

The in vitro developmental ability of frozen-thawed enucleated oocytes receiving a donor blastomere of embryos fertilized in vitro was studied. All recipient oocytes were enucleated before freezing and were activated 9 hours before fusion with a donor blastomere from 8-to 20-cell stage embryos. The enucleated oocytes were frozen in 1.0 or 1.5M glycerol by conventional slow cooling methods. The developmental ability of oocytes was slightly higher when they were frozen before rather than after activation (in experiment 1). The developmental ability to 2-cell and 8-cell stage was high (70% and 26%, respectively) when aged oocytes (32 hours of maturation at activation) were used, but the development to blastocyst was only observed in young oocytes (23.5 hours) receiving a donor blastomere (2% in experiment 2). Although the developmental ability to 8-cell stage of frozen-thawed nuclear transferred oocytes was low (15%), a small ratio of them developed to blastocysts (2%).

Effect of aging of oocytes on the in vitro developmental ability of bovine parthenogenetic eggs were examined. The oocytes with a first polar body were activated at 24 (young) or 44 hours (aged) after starting of in vitro maturational culture by electric stimulation, then they were incubated in the medium supplemented with cytochalasin B and cycloheximide (CY) for 6 hours. After incubation, they were cultured with cumulus cells for 8 days in vitro. Karyoplast and cytoplast were separated from young and aged oocytes, respectively. Then, 4 combinations of reconstituted oocytes were produced, activated and cultured in vitro. A blastomere from in vitro fertilized 32 to 64 stage embryos was fused with enucleated young or aged cytoplast, and reconstituted oocytes were cultured in vitro. Results obtained were as follows. (1) The activation rate of young oocytes significantly increased after CY treatment (19% vs 97%). (2) The developmental ability of aged parthenogenetic eggs was significantly low compared with that of young oocytes. (3) Experiments on the exchang of karyoplast and cytoplast between young and aged oocytes, and nuclear transfer revealed that the low developmental ability of aged parthenogenetic oocytes was due to the developmental deficiency of chromosomes and cytoplasmic factor (s).

In vitro development and changes in the nuclei of reconstituted oocytes following fusion were investigated to determine the effects of cell cycle stage of donor nuclei on bovine nuclear transplantation. Enucleated oocytes, cultured for 44 to 46 h following maturation or preactivated for 9 h before fusion, were used as the source of recipient cytoplasm. Donor embryos were obtained from embryos matured, fertilized and cultured in vitro. Blastomeres of the embryos which had developed to the 4-cell stage at 39 h after insemination were separated. Each blastomere was cultured with aphidicolin for 2 to 4 h. These blastomeres, shortly after the next division (G₁/S stage of the cell cycle), or those cultured for 6 h without aphidicolin after division (S stage of cell cycle), were fused with non-activated (Groups 1 and 3) or activated (Groups 2 and 4) oocytes. The proportion of embryos which developed into blastocysts were higher in Groups 2 (16%) and 4 (17%) than in Groups 1 (10%) and 3 (6%). The diameter of the nuclei after fusion with the recipient cytoplasm increased, but to a lesser extent in activated than in the non-activated cytoplasm. Some nuclei which had fused with non-activated cytoplasm showed nuclear envelop breakdown and premature chromosome condensation (PCC, 21%). No donor nuclei showed PCC when fused with activated cytoplasm.

Effects of leukemia inhibitory factor (LIF) on the developmental ability of mouse 8-cell embryos in vitro and in vivo were examined.(1) Eight-cell embryos were cultured with M16+LIF medium in vitro to examine the development to blastocysts and the attachment to culture dish.(2) Blastocysts were transferred to recipient mice following the injection of LIF into the uterine lumen to examine the number of live youngs on Day 17. The results obtained were as follows.(1) When embryos were cultured in a medium supplemented with LIF, the proportion of embryos developed to hatched blastocysts was increased. Blastocysts cultured in the presence of LIF and 10% FCS attached to the surface of the culture dish at a significantly higher frequency than control blastocysts (42vs71-90%).(2) The proportion of embryos that developed into live young was significantly increased, when the LIF was directly injected into the uterine lumen, compared with the control group (15 vs 35%).

本実験では,遺伝子標的導入法によりA群色素性乾皮症原因遺伝子(XPAC)の一方の対立遺伝子を破壊したES細胞を用いて,両対立XPAC遺伝子が破壊されたホモマウスの作出を試みた.ES細胞は野生色で雄の核型を示すF1/1を用い,実験には4株の遺伝子導入細胞を用いた.これらの細胞をアルビノマウス由来4～16細胞期胚の囲卵腔に注入して集合させ,一晩培養後偽妊娠マウスに移植した.得られた雄キメラマウスはCD-1系雌と交配し,有色の産子は離乳時にサザンブロッド解析を行なってヘテロ接合体個体を選別した.また,ヘテロ個体同志の交配を行ないホモ接合体マウスの作出を試みた.各株でそれぞれ71～308個の集合胚を作出したが,そのうち90～100%が桑実胚～胚盤胞へ発生した.受胚雌へ移植後の産子への発生率(1～24%)ならびにキメラマウスの作出率(0～16%)は,ともに1株を除いてコントロール区(それぞれ24,47%)と比べて有意に低い値であった.8匹の雄キメラマウスのうち,生殖系列キメラは1匹(13%)であった.この雄キメラマウスをCD-1系難と1～6回交配することによって得られた産子のうち73%が変異遺伝子をヘテロにもつことが判明した.また,雌雄のヘテロ同志の交配により得られた産子の26%がホモ接合体であった.本実験において,両方のXPAC遺伝子が破壊されたホモ接合体マウスの作出に要した期間は約16ヵ月であり,妊娠期間が長く産子数の少ない家畜に本法を適用するためには,ES細胞由来の個体を直接作出するための技術開発が必要と考えられた.

卵巣より吸引採取したウシ卵胞卵子の体外受精後の発生能に及ぼす培養液量と培養卵数との比の影響について検討した.その結果,培養液量が10μlの条件下(実験1)では,培養卵数が2,5,10または20個の場合,胚盤胞への発生率が13.6～20.0%と,1,40または60個培養した場合の2.0～5.6%に比べて有意に高かった.また,胚盤胞への発生時期は,5および10個培養区が他区に比べて早かった.しかしながら,培養液量と培養卵数の比を一定とした場合(実験2),5～100μlの範囲では培養卵数はウシ体外受精卵の発生率に影響を与えなかった.

ウシ核移植卵の体外発生能に及ぼすドナー割球とレシピエント卵細胞質との融合時期ならびに培養液添加物の影響について検討した.既報に従って除核し,レシピエント卵の囲卵腔に体外受精由来8～32細胞期胚の単一割球を注入した.ついで,成熟培養開始後30時間目あるいは40時間目に電気刺激を与えた.融合卵は,ホルモン,あるいはSODとThioredoxinを添加したTCM199液,またはグルコースをグルタミンに置換したM16液にそれぞれ5%CSを加えて卵丘細胞と共培養し,体外での発生能を検討した.得られた結果は次のとおりである.8細胞期以降の発育は,40時間目に融合刺激を与えた各区で高い傾向がみられ,融合時期を遅らせるとその後の発生に効果的であることが明らかとなった.しかしながら,ホルモン,SOD,グルタミンの添加によって発生率に改善は見られず,これらの添加は胚の発生能を向上させる効果のない結果となった.

マウス2細胞期胚の割球を電気刺激により融合して4倍体胚を作製し,体外における胚盤胞への発生率ならびに受卵雌に移植後の胎子への発生能について検討した.また,4倍体胚の細胞数を補足してその後の発生能に及ぼす影響を調べるため,4倍体胚を2個集合したのち培養ならびに移植試験を実施した.得られた結果は次のとおりである.
(1) 電気刺激後,72%の割球が融合し,胚盤胞期へ76%が発生した.しかしながら,胚盤胞期における細胞数は,無処理胚の約半数であった(30±5対64±11).(2) これらの胚盤胞を受卵雌へ移植したところ,妊娠11.5日目の開腹検査で79%の着床痕が確認されたが,生存胎子は観察されなかった.(3) 4倍体集合胚は,85%が胚盤胞へ発生した.胚盤胞期における細胞数は,集合しない胚と比べて約1.6倍に増加していた(43±4対67±12).しかしながら,受卵雌へ移植後,妊娠9.5あるいは11.5日目の開腹検査で,66%の着床痕が確認されたにもかかわらず,生存胎子はいずれの場合もみとめられなかった.
以上の結果より,4倍体胚の着床後早期死滅の原因は細胞数の不足だけではないことが明らかとなった.

The present study was undertaken to examine the effects of culture media (M16) stored by freezing (-20°C) or freeze-drying on the development of mouse zygotes or 2-cell embryos in vitro and in vivo.
Zygotes and 2-cell embryos were obtained from the superovulated CD-1 female mice mated with CD-1 males on 19-23 or 43-46 hrs after hCG injection, respectively. Zygotes with two pronuclei were cultured for 4 days with fresh and frozen media supplemented with 100 μM EDTA. Two-cell embryos were cultured for 3 days with fresh, frozen and freeze-drying media. Some blastocysts developed from zygotes or 2-cell embryos cultured with each media were transferred into the oviducts on day 0.5 or into the uteri on day 2.5 or 3.5 of pseudopregnant mice. They were killed on day 16.5 or 17.5 to examine the number of live fetuses. Cell numbers in both trophectoderm and inner cell mass of blastocysts on freeze-drying media were also examined.
High proportions of zygotes and 2-cell embryos cultured with frozen and freeze-drying media developed to blastocysts in vitro (59% and 86% for frozen medium, 89% for freeze-drying medium), and were not significantly differentcompared with those obtained in fresh medium (59% and 86%).
The proportion of live fetuses after transfer of blastocysts developed from zygotes or 2-cell embryos with frozen medium (34% and 31%) were not significantly different from those obtained with fresh medium (35% and 39%, respectively). However, only 8% of embryos cultured with freeze-drying medium developed to fetuses. But, the cell numbers in trophectoderm and inner cell mass of blastocysts were not significantly different from those obtained with fresh medium.
The present study demonstrated that M16 medium could be preserved at least for 10 months at -20°C without the decrease of its potency for the development of mouse embryos in vitro and in vivo. However, although the reason was not clear, freeze-drying of medium resulted in a drastical decrease in the percentage of embryos developing to live fetuses after transfer to recipients.

始原生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)は,将来卵子あるいは精子へ分化することのできる唯一の細胞群である.卵子や精子は,受精後全能性を獲得するが,体細胞から分離された胎子期の生殖細胞が多能性あるいは全能性を保有しているか否かは明らかにされていない.
本実験は胎子期の生殖細胞と8~16細胞期胚との集合を行い,再構築胚のその後の発生能について検討した.集合は,2つの方法を用いて実施した.すなわち,(1)妊娠12.5~16.5日齢のアルビノマウスの雌雄胎子より採取した生殖細胞を透明帯を除去した有色マウス由来8~16細胞期胚と集合する方法,(2)数個~10個の生殖細胞を透明帯の一部をカットした8~16細胞期胚の囲卵腔に注入する方法の2種である.得られた結果は次の通りである.(1)透明帯除去8~16細胞期胚と集合させた311個の胚のうち294個(95%)が桑実胚~胚盤胞へ発生した.そのうち269個を32匹のレシピエントに移殖したところ57匹の産子が得られたが,生殖細胞由来の遺伝形質を示す個体はみられなかった.(2)透明帯カット8~16細胞期胚との集合の結果,533個の胚のうち513個(96%)が桑実胚~胚盤胞へと発生し,500個を47匹のレシピエントに移殖し,142匹の産子を得たが,(1)と同様にキメラ個体は得られなかった.

始原生殖細胞(Primordial germ cells, PGCs)は,将来卵子あるいは精子へ分化することのできる唯一の細胞群である.卵子や精子は受精後全能性を獲得するが,減数分裂以前のPGCsが全能性あるいは多能性を保有しているか否かは明らかにされていない.本実験は,今後,集合法や核移植技術等を用いて,そのような能力を検討するための基礎資料を得ることを目的として,胎子の性別や日齢の生殖隆起の形態変化,およびPGCsのアルカリフォスファターゼ活性に及ぼす影響,ならびに体外での保存時間に伴う生存性の変化についてそれぞれ検討した.得られた結果は次のとおりである.胎子の日齢が進むにつれて生殖隆起は雌雄ともに短径と長径の比が1に近づき,しだいに長形から円形へと丸くなっていくことが判明した.PGCsのアルカリフォスファターゼ活性は減数分裂開始後も低下しないことが判明した.PGCsを室温で1~5時間保存しても,保存時間に伴って生存率は低下しないことが判明した.

家畜の核移植に関する情報を提供した。

胚細胞、体細胞の核移植について情報を提供した。

核移植方法、 ES 細胞を樹立したマウスの遺伝的背景並びに細胞周期の違いがマウス ES 細胞由来核移植卵の体外並びに産子の発生能に及ぼす影響について検討した。

培養中の酸素濃度の影響について検討した。

ブタ体細胞核移植卵の 10％が胎盤胞へ発生することを明らかにした。

核移植卵の発生能に及ぼす再核置換ならびに集合の影響について

ブタではヒトの臓器移植を目指した研究が多く、現在では畜産分野への貢献を目指した体細胞核移植研究は少ない。そのため、ウシやマウスとは異なり、核移植のドナーとして用いる細胞の種類と核移植卵の発生能とを結びつける系統立てた情報は少ない。そこで、本研究では、ブタで様々な組織から細胞を採取し適切な培養法を検討し、それらを用いて核移植を行い、発生能を検討する。これらの知見を得て、最終目的としてブタ体細胞核移植実験系の改善を目指す。H27年度に、海外特別研究員は、本人にとって全く新しい技術である、哺乳動物卵子・初期胚の取り扱い、体外成熟培養、単為発生、核移植、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の検討などを順調に習得したので、H2７年度はブタ体細胞核移植の体外発生能向上を目指した研究を実施した。すなわち、体細胞核移植卵の活性化方法の検討、ドナー細胞核の除核レシピエント卵への導入方法の検討、ドナー細胞種の影響；特に幹細胞の有用性の検討、培養方法を検討した。その結果、活性化方法、ドナー核の導入方法では、検討したいずれの方法でも、胚盤胞への発生率、胚盤胞の細胞数に大差はみられなかった。また、ドナー細胞としてブタiPS細胞を用いても、体外発生能や細胞数は、体細胞を用いた場合と比較して大差が見られなかったことから、幹細胞であっても卵子細胞質内で生じる初期化が強く促進されるわけではないと示唆された。培養培地にPHAを添加したところ、体外発生率が増加する傾向がみられた。

本研究では、マウスとブタの胚盤胞を用いて、凍結乾燥保存を試みた。マウス胚盤胞を用いた検討では、トレハロース添加溶液を用い元に戻す時に多量の等張液を用いることで、凍結乾燥後の胚盤胞の状態が改善されることがわかった。ブタ胚盤胞ではトレハロース添加区を含めいずれの検討区においても、凍結乾燥後、元に戻しても胚盤胞の形態は回復しなかった。以上の結果から、マウス胚盤胞では凍結乾燥保存できる可能性が示され、ブタではより工夫が必要であることが示された。

本研究では,平成23年度に引き続き,体細胞核の初期化を促進する天然物を探索し,各天然物同士の種々の組み合わせを含めながら,初期化を促進すると考えられるものを選び出すことを最終目的として実施した。すなわち,滋養強壮,不妊治療,傷の治療などに効果があるとされている生薬を中心とした約100種類の天然物の中から,平成16年度～19年度の基盤A研究(研究分担者)「初期化誘導活性を持つ天然物の探索;クローン個体の作出,未分化対細胞株樹立への応用」ならびに平成21～22年度の当該領域研究「天然物を利用した体細胞核の初期化促進に関する研究」の中で得られた知見に基づき,初期化の促進に有効と考えられるものがないかどうかを,マウス胚を用いて検討した。まず,前核期から胚盤胞までの体外培養時に,培地に添加して胚盤胞への発生能を向上させないかを検討した。また,胚盤胞期へ発生したものについては,細胞数が増加していないかを検討した。さらに,体細胞の培養時に培地に添加して,細胞増職能に効果がないかを検討した。その結果,これまでのところ,百数十種類の生薬を用いて調べたところ,7種類の生薬において,胚盤胞への発生能の向上,あるいは,胚盤胞期における細胞数の増加,また,体細胞の細胞増殖能の促進に効果のある可能性が示唆された。これらの生薬が,体細胞核移植卵を用いた場合に同様に発生能を向上させる効果があるのかどうか検討した結果,顕著な際は認められなかった。さらに,他の動物種の胚を用いた場合に,顕著な効果はみられず,現在検討中である。

体細胞核移植卵の発生能は,核移植時にヒストン蛋白質のアセチル化を修整する処理(TSA処理)や初期化に関与するタンパク質(TCTP)の導入等を行うことで,多少改善されるが,劇的な向上には結びつかず,正常産子生産率は依然として数パーセント程度である。そのため,体細胞核を正しく初期化させて正常に発生させるには,ピンポイントの救済術では不十分である可能性があると考えられる。 本研究では,体細胞全体,あるいは卵全体の潜在的な生命力を高めることを期待して,天然物を用いた初期化促進法の開発,ならびに,天然物による胚の質の改善と向上を試みた。本年度は下記を中心に実施した。 前年度に引き続き,受精卵を用いて初期化を促進する天然物ならびに胚の質を改善する天然物の探索を行った。また,前年度までの結果から効果が見られた天然物数種類を用いて,受精卵の体内発生能の検討ならびに,核移植卵の発生能に及ぼす影響を検討した。核移植法は,当研究室の常法(Cloning and stem Cells., 10,133,2008.など)に従い,それぞれの天然物添加培地を用いて培養した。そして,受精卵,核移植卵のいずれも,胚盤胞への発生能とそれらを受胚雌へ移植後の妊娠中期の胎子,あるいは,正常産子への発生能を検討した。核移植卵においては,胚盤胞への発生能に対照区と大差がみられなかった。受胚雌へ移植後の体内発生能も,受精卵,核移植卵いずれにおいても,劇的な向上はみられなかった。

犬や猫等の愛玩動物では外科的去勢手術が行われているが、簡便で確実な動物の受胎調節法が存在しないため、保護の進んだ野生動物、動物園動物、外来動物の一部では、個体数の増加の制御が困難な場合が有り、人間の生活権との間で葛藤が見られている。研究代表者らは、別の目的で実施してきた研究の中で、生薬であるオウレンがマウス初期胚の発生能を阻害する可能性があることを見いだした。そこで本研究では、オウレン抽出物が動物の避妊薬として使用できるか否か検討する目的で実施した。 1 オウレン抽出物が前核期受精卵の発生能に及ぼす影響;水で煮沸後、上清を凍結乾燥した後用いた。その結果、1mg/ml以上の濃度でオウレン抽出物を添加した培地でマウス前核期受精卵を培養すると、胚盤胞への発生が完全に阻害された。 2 卵子の受精能に及ぼす影響;種々の濃度で添加した培地でマウス未受精卵を1時間前培養し、受精能を獲得させた精巣上体精子液に移して体外受精を行った。その結果、受精と胚発生は正常におこり、卵子の受精能は阻害されないことが明らかとなった。 3 精子の受精能力に及ぼす影響;種々の濃度で添加した培地にマウス精巣上体精子を入れて受精能を獲得させ、ついで未受精卵を移して体外受精を行った。その結果、受精は正常におこり、オウレン抽出物は精子の受精能力を阻害しないことが判明した。 4 雌への投与の影響;過剰排卵雌に1mgの抽出物を7日間筋肉内投与後交配し、採卵して、胚盤胞への発生状況を調べた。その結果、PBS投与区と比べて胚盤胞への発生率に大差は見られなかった。しかしながら、オウレン投与雌では、回収卵数が有意に少なく、排卵抑制効果あるいは生体内における受精卵発生能阻害または流出効果がある可能性が示唆された。 オウレン抽出物の主要成分は、塩化ベルベリンとされている。そこで今後、市販の塩化ベルベリンを用いて、受精卵の発生能阻害作用と避妊効果が有るか否か調べる予定である。

研究代表者らは、未受精卵細胞質中に、核の初期化誘導に関わる蛋白質(リン酸化TCTP)を同定し、リン酸化TCTPペプチドを導入した体細胞を核移植に用いると、クローンウシが高率に得られる事を明らかにした。そこで、マウス核移植実験系を用いてリン酸化TCTPの持つ初期化誘導能を確認する事を目的に実施した。これまでは、接着細胞であるウシ培養細胞へ不活化センダイウイルスを用いる方法(GenomeOne)でペプチドを導入し、核移植に用いてきた。しかしながら、マウス体細胞の核移植で確実に産子の得られる細胞は、浮遊細胞である卵丘細胞や短期間培養する卵胞上皮細胞に限られている。これらの細胞へGenomeOneを用いてペプチド導入を行うと、細胞融合が高率に生じた事から、前年度はペプチドの効率的導入法を検討してきた。本年度は、これらの手法を用いて、リン酸化TCTPペプチドの導入がマウス体細胞核移植卵の発生能に及ぼす影響を検討した。卵胞上皮細胞ヘリン酸化ペプチドを導入し、除核未受精卵細胞質に直接注入法を用いて核移植した。ついで、トリコスタチンA (TSA)添加培地で前培養し、TSA添加活性化培地で6時間培養して活性化後、体外で4日間培養して胚盤胞へ発生させた。つぎに、胚盤胞を受胚雌に移植して胎子への発生率を調べた。なお、対照区として、非リン酸化ペプチド導入体細胞を用いた。その結果、胚盤胞への発生率は、実験区49% (176/358)、対照区57% (104/183)と有意差が見られなかった。また、妊娠10.5日目における生存胎子の割合も両区で大差は見られなかった。リン酸化ペプチド導入を導入した体細胞におけるOct4蛋白質の発現の有無を調べたが、検出する事は出来なかった。本実験いた事による可能性が考えられた。

1.培養細胞を用いた天然物の探索;Oct4・GFPトランスジェニックマウス胎子より樹立した胎児繊維芽細胞を用いて,Oct-3/4遺伝子の発現を誘導する天然物をスクリーニングした。すなわち、天然物を原形あるいは刻で購入し、ホモゲナイズ後遠心して上清を採取し、凍結乾燥後培地に10,1,0.1,0.01,0.001mg/ml添加した。ついで、添加培地で繊維芽細胞を2〜7日間培養し、GFP観察用専用顕微鏡下で観察して、GFPを発現する細胞数と発現の強度を計測した。用いた生薬は,滋養強壮薬、不妊治療薬、傷の治療薬、健康栄養食品、種々の漢方薬等を中心とする506種である。その結果、4種の生薬水抽出物中に、Oct4遺伝子発現を誘導する活性を持つ事が判明した。しかしながら、誘導活性は極めて弱かったことから、これらの4種の生薬を用いてメタノール抽出を行った。Oct4遺伝子の発現の有無を調べたところ、No.212ならびに378生薬に弱い活性を認めた。また、これらの生薬処置体細胞よりmRNAを抽出後、リアルタイムPCR法でOct4mRNAの発現の有無を調べたが、明確な結果は得られなかった。2.初期胚を用いた探索;過剰排卵処置マウスから回収した初期胚を用いて、生薬抽出物が発生能や胚盤胞形成時期に及ぼす影響を検討した。その結果、発生能の向上や分化時期に影響する生薬は見られなかったが、得られた胚盤胞の細胞数が、対照区に比べて20%以上増加する生薬が5種認められた。また、生薬Nos.63、38、86では0.1ug/mlの低濃度でも初期胚の発生を完全に阻害する予想外の成果が得られた。生薬63と86の抽出物の主要成分は共通する事が判明している。化学合成されている薬剤を用いて初期胚の発生能への影響を調べたところ、生薬抽出物と同様に完全に発生能を阻害する事が判明した。現在、これらの生薬抽出物が動物避妊薬として有用であるかを検討している。3.ウシ未受精卵細胞質中に、核の初期化誘導に関わる蛋白質(リン酸化TCTP)を同定し、あらかじめリン酸化TCTPを導入した体細胞を核移植に用いると、正常なクローンウシが高率に得られる事を明らかにした。

前年度は,体細胞あるいはES細胞を除核未受精卵へ核移植後,胚盤胞への発生能を支持しなくなる卵細胞質を作り出す条件を検討した。今年度はその結果を参考に,発生を支持する能力を持つ卵細胞質と支持しない卵細胞質との間で2次元電気泳動等を行ない,両者間にタンパクレベルで差異があるかどうかを調べた。 方法:MII期未受精卵に電気刺激等による活性化刺激を付与した卵子を集め,活性化刺激を付与していない卵子との間で2次元電気泳動による比較をおこなった。 結果:両者の2次元電気泳動像を比較検討したところ,1カ所で著しい差異のあるスポットが見つかったので,スポットの差異に注目して詳細を検討した。その結果,それはヒトやマウス等で既知のタンパクであることが分かった。今後,そのタンパクの性質やそれが初期化に直接関与しているかをさらに詳細に検討する必要があると考えている。

本研究では,体細胞核移植をより確実な技術にすること,また,核移植を介さない細胞の初期化法を確立することを最終目的として実施した。すなわち,卵子に含まれる初期化因子の実体を探るとともに,初期割球や培養細胞を様々な角度から受精卵に近付ける工夫を行なった。また,現在の体細胞核移植法では,クローン胚の発生率が低く,高頻度で死亡することから,正常に発生するための工夫を行なった。 本年度は以下の実験を行なった。ウシMII期末受精卵に電気刺激による活性化刺激を付与し,電気刺激を与えていない卵子と与えた卵子との間で,予備的に2次元電気泳動をおこない,タンパクレベルでの差異がみられるかどうかを条件設定した。その結果,20個の卵子を用いて,差異のあるスポットを検出することができた。 マウスMII期の卵子の回収率の高いタンパク採取法について検討した100個のMII期卵子の透明帯を除去し,その後,(1)界面活性剤や還元剤を含まないバッファ,(2)界面活性剤や還元剤を含むバッファ,(3)より強力な界面活性剤や還元剤を含むバッファで可溶化した上清を2次元電気泳動に供した。その結果,(1)界面活性剤や還元剤を含まないバッファで処理した場合に解析可能なスポットを複数見つけることができた。 現在は,ウシとマウスの卵子を用い,活性化を付与したものと付与しないものとの間におけるタンパクレベルの差異をより詳細に検討中である。

胚性幹細胞(ES細胞)とは、1個の胚盤胞内細胞塊に由来する継代培養可能な細胞であり、他の胚と集合したり注入したのち受胚雌に移植するとキメラ個体が得られることから、遺伝子組換えを行ったES細胞から作出したキメラを正常なマウスと交配することによって多数のモデルマウスが作出されている。1999年に、ES細胞を除核未受精卵へ移植することによって生殖能力を持つマウス個体が得られる場合のあることが明らかとなった。しかしながら、産子への発生率は極めて低く、また得られた産子の多くは分娩直後に死亡することが明らかになっている。遺伝子組換えを行ったES細胞から正常な胎子や生殖能力のあるマウスを高率に得る技術が樹立できると、現在のキメラを介する方法にとってかわることとなり、実験動物学や基礎医学分野の研究への波及効果はきわめて大きい。そこで本研究では、高率にES細胞由来の産子を得ることを最終的な目的として、核移植卵の発生能に及ぼす諸条件を検討した。その結果、次の成果を得た。 検討した項目は、核移植卵の集合による細胞数の増加、ES細胞の遺伝的背景、細胞周期、核移植方法、融合方法、活性化刺激方法、核移植卵の発生速度の影響である。本研究によって、マウスES細胞の核移植によって確実にクローンマウスを得ることができるようになった。しかしながら、核移植卵の体外における発生率は40〜80%と高いが、産子への発生率は1〜5%と低く、産子生産率を向上させるための検討がさらに必要と考えられた。

本研究では,まず,未受精卵あるいは受精卵をレシピエント卵細胞質とした核移植を行なうことにより,「初期化因子」が存在すると考えられる細胞質のステージを特定し,ついで「初期化因子」の実体を明らかにすることを目的として予備的実験を行なった。本年度では,これまでにマウス卵子で観察された上記の現象が他の動物種においても共通であるかどうかを検討したのち,卵細胞質に存在する「初期化」因子を含む分画を単離する目的として予備的実験を試みた。 前年度までに,(1)マウス未受精卵細胞質には,ドナー細胞核を初期化して受精卵と同じような初期発生を誘起する因子が存在すること,(2)一旦受精した卵細胞質にはそのような因子が存在しないことを明らかにした。今年度は,他の動物種(ウシ)のサンプルを用いた核移植においても,マウスと同様の結果がみられるかどうかを検討した。その結果,マウスの核移植で見られた現象と同様の傾向が観察できた。すなわち,ウシ除核未受精卵をレシピエント卵細胞質として核移植すると,体細胞核を高率に初期化するが,一旦活性化刺激を付与された未受精卵では,初期化できないということが観察された。これらのことから,受精あるいは受精と同等の活性化刺激を付与することにより,卵細胞質中の「初期化」に関わる因子が消失することが推察された。また,卵細胞質中に存在すると考えられる初期化因子を単離するための予備実験として,細胞質の因子を効率的に回収する方法について,体細胞をモデルとして検討した。その結果,細胞を少量の2次蒸留水に浮遊し,極細注射針でホモゲナイズした後,低速遠心する方法により,核のみが沈殿した細胞質溶液を作出できることが明らかとなった。今後は,このような方法によって,卵細胞質溶液を採取し,初期化因子を失った卵細胞質に注入することによって,初期化作用が回復するか否かを検討する予定である。

胎子から取り出した生殖細胞をドナー細胞として核移植を行ったところ、120個の再再構築2細胞期胚が作出できた。それらの胚をさらに1晩培養後に分裂した胚105個を受精卵由来4〜8細胞期胚と集合したところ、90%が胚盤胞へ発育し、18匹の偽妊娠受胚雌に移植した。ついで、10.5〜14.5日目に開腹したところ、それぞれ、54%〜100%の胚が回収された。そのうち、正常に発育していると判定されたものは、56〜72%であった。GPI分析の結果、10.5日目の分析では、正常胚のうち1例の胎盤と胎膜にそれぞれドナー細胞の寄与がみとめられ、既に死滅した胚においても1例で寄与が見られた。12.5日目の分析では、2例の胎盤に寄与がみられ、死滅胚のうち3例にドナー細胞の寄与が見られた。14.5日目の検査でも、胎盤、胎膜にそれぞれ1例ずつ、ドナーの寄与がみられた。しかしながら、移植後分娩させたマウスにキメラは含まれていなかった。11.5日齢の生殖細胞を用いた場合も、14.5〜16.5日齢の細胞を用いた場合と同様に、受胎産物にキメリズムをみることができた。しかしながら、胎子への寄与はみられず、胚体外組織にのみその寄与がみられた。また、死滅した受胎産物で高率に寄与していたことから、14.5〜16.5日齢の細胞の場合と同様に、ドナー由来細胞が発育の過程で何らかの理由により脱落していったかあるいは、発育を阻害していることが示唆された。また、本実験では用いた日齢のドナー細胞の遺伝情報を完全に「初期化」することができなかったことが明らかであり、今後、ドナー細胞を「初期化」する方法の改善や、この「初期化」現象の機構について解明する必要があると考えられる。