Abstract The oxygen‐permeable poly(dimethylsiloxane) (PDMS) membrane covered with platinum nanoparticles‐decorated single‐walled carbon nanotubes (PtNP/SWCNT/PDMS) was examined as a biocompatible and transparent gas diffusion electrode sheet for the first‐generation electrochemical biosensor to resolve oxygen depletion at the electrode surface. Due to the oxygen supply to the PtNP‐decorated SWCNT layer through the PDMS membrane, a cathodic current based on the oxygen reduction reaction for PtNP/SWCNT/PDMS was about 5 times larger than that for without oxygen supply through PDMS under an air‐saturated 67 mM phosphate buffer (pH 7.4). In addition, an anodic current of hydrogen peroxide (H₂O₂) oxidation was also observed at the PtNP/SWCNT/PDMS electrode in the phosphate buffer. Based on these results, the PtNP/SWCNT/PDMS electrode modified with oxygen‐dependent oxidase enzymes, such as glucose oxidase (GOx), successfully enabled that upper detection limit of H₂O₂ produced from the GOx‐catalyzed oxidation of glucose was improved in comparison with that without oxygen supply through PDMS. The PtNP/SWCNT/PDMS electrode sheet would therefore be applied to not only first‐generation electrochemical biosensors but also enzyme‐based biofuel cells with enhanced performance.

Microphysiological systems (MPS) incorporating microfluidic technologies offer improved physiological relevance and real-time analysis for cell-based assays, but often lack non-invasive monitoring capabilities. Addressing this gap, we developed a microfluidic cell-based assay platform integrating an electrochemical biosensor for real-time, non-invasive monitoring of kinetic cell status through glucose consumption. The platform addresses the critical limitations of traditional cell assays, which typically rely on invasive, discontinuous methods. By combining enzyme-modified platinum electrodes within a microfluidic device, our biosensor can quantify dynamic changes in glucose concentration resulting from cellular metabolism. We have integrated a calibration function that corrects sensor drift, ensuring accurate and prolonged short-term measurement stability. In the validation experiments, the system successfully monitored glucose levels continuously for 20 h, demonstrating robust sensor performance and reliable glucose concentration predictions. Furthermore, in the cell toxicity assays using HepG2 cells exposed to varying concentrations of paraquat, the platform detected changes in glucose consumption, effectively quantifying the cellular toxicity responses. This capability highlights the device’s potential for accurately assessing the dynamic physiological conditions of the cells. Overall, our integrated platform significantly enhances cell-based assays by enabling continuous, quantitative, and non-destructive analysis, positioning it as a valuable tool for future drug development and biomedical research.

Abstract Cup-stacked carbon nanofibers (CSCNFs), the surface of which provides highly ordered graphene edges and electroactive oxygen-containing functional groups, were investigated as electrode materials for oxidation of β–Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) at low overpotential. The NADH oxidation was facilitated at the CSCNF-modified glassy carbon (CSCNF/GC) electrode, the surface of which was electrochemically activated at –0.40 V (vs. Ag|AgCl) to generate electrochemically reduced electroactive oxygen-containing functional groups. The anodic peak current of NADH oxidation was observed at about + 0.065 V by cyclic voltammetry measurements. The obtained value was negatively shifted by ~ 0.33 and ~ 0.63 V compared with the CSCNF/GC electrode without the electrochemical reductive pretreatment and the GC electrode, respectively. In addition, NADH-dependent glucose dehydrogenase (GDH) molecule-modified CSCNF/GC electrodes enabled the detection of glucose at the low overpotential effectively in the presence of NAD⁺, which accepts electrons from GDH and then reduces to NADH, after the electrochemical reductive pretreatment. Thus, the electrochemical reductive pretreatment of CSCNF electrodes would be useful for the development of highly sensitive NADH-dependent enzymatic biosensors. Graphical abstract

A transparent high density thin-film-transistor microelectrode array (TFT-µEA) was investigated, for the first time, to apply to real-time electrophysiological monitoring on glucose-stimulated insulin secretion dynamics of pancreatic β cells at higher resolution than conventional microelectrode arrays (MEAs). TFT-µEAs employed in this work are designed based on the switch matrix architecture, which incorporates a large sensing area (15.6 mm × 15.6 mm) with a 150 × 150 array of indium-tin-oxide (ITO) microelectrodes placed at a 100 µm pixel pitch. TFT-µEAs coated with poly-L-lysine and laminin enabled to culture rat insulinoma β line iGL for at least 7 days without cell death, which was determined by conventional cell viability tests based on a fluorescent staining method. Real-time action potentials of iGL cells stimulated by 15 mM glucose were successfully observed in similar to those in a conventional MEAs. These results are the first step towards the development of a multimodal TFT-µEAs device for electrophysiological, biochemical and optical analyses of the pancreatic islets. TFT-µEAs would extremely be promising platforms in the bioanalysis field for neurochemistry and electrophysiology.

Examining intestine–liver interactions is important for achieving the desired physiological drug absorption and metabolism response in in vitro drug tests. Multi-organ microphysiological systems (MPSs) constitute promising tools for evaluating inter-organ interactions in vitro. For coculture on MPSs, normal cells are challenging to use because they require complex maintenance and careful handling. Herein, we demonstrated the potential of coculturing normal cells on MPSs in the evaluation of intestine–liver interactions. To this end, we cocultured human-induced pluripotent stem cell-derived intestinal cells and fresh human hepatocytes which were isolated from PXB mice with medium circulation in a pneumatic-pressure-driven MPS with pipette-friendly liquid-handling options. The cytochrome activity, albumin production, and liver-specific gene expressions in human hepatocytes freshly isolated from a PXB mouse were significantly upregulated via coculture with hiPS-intestinal cells. Our normal cell coculture shows the effects of the interactions between the intestine and liver that may occur in vivo. This study is the first to demonstrate the coculturing of hiPS-intestinal cells and fresh human hepatocytes on an MPS for examining pure inter-organ interactions. Normal-cell coculture using the multi-organ MPS could be pursued to explore unknown physiological mechanisms of inter-organ interactions in vitro and investigate the physiological response of new drugs.

肝細胞は肝組織内の部位によって異なる機能を発現していることが知られており，本研究では肝組織内の酸素濃度勾配に着目し，これに対応した細胞機能を解析することが可能とするデバイスの開発を進めている．本報では，新たにデバイス内の異なる部位ごとに細胞を回収して解析することが可能な構造を考案し，これについて流れの解析および流量パラメータの検討などを行ったので，その結果について報告する．

デバイス表面のガス透過性を低下させることで，デバイス外の環境に関わらず，上流から下流にかけての細胞による酸素消費のみによる溶存酸素濃度の変化を捉えることのできる肝細胞培養マイクロ流体デバイスを製作した．酸素感応性蛍光色素を混合した薄膜を用いてデバイス内の酸素濃度を可視化する手法を考案し，流入口と流出口に配置した酸素センサによる測定結果を用いてこの手法を評価した．

この１年目では、予定通りこの次の結果が得られました。（１）透明TFT電極アレイ基板表面での膵β細胞培養法の構築」では、発光性ラット膵β細胞株iGLが安定して接着培養できる基板表面の条件を明確にしました。透明TFT電極アレイの電極材料は酸化インジウムスズ（ITO）であり、この表面を適切に処理することで、細胞接着因子（コラーゲンやラミニンなど）を物理的または化学的に固定化させた後、iGL細胞を播種して接着性を確認しました。また、TFT電極アレイ表面に固定化したiGL細胞に高濃度グルコースを暴露し、細胞から分泌されるインスリンをELISA技術で確認しました。「（２）膜電位の高感度評価技術の構築」では、これまでに検討してきている心筋細胞や神経細胞の透明TFT電極アレイ計測システムをベースとして、iGL細胞の膜電位計測の最適条件を明確にしました。これと並行して、心筋や神経細胞の膜電位計測で広く利用されている微小電極アレイでiGL細胞の膜電位変化応答を計測することで、TFT電極アレイでの応答と比較しました。

創薬分野では非臨床試験において、実験動物を使ったin vivo試験や培養細胞を用いたin vitro試験が実施されているが、ヒトと実験動物の種差やin vivoとin vitroの乖離に起因する医薬品開発コストの増加が社会的問題となっている。そこで本研究では、この乖離を補完するための高次in vitro系として、マイクロ流体デバイス技術を活用した機能統合型Body-on-a-chipの構築を目指す。具体的には、本研究では医療・創薬分野への応用を見据えつつ、生物学的に新しい知見を得るための高次in vitro系として、①ADME（吸収(Absorption)・分布(Distribution)・代謝(Metabolism)・排泄(Excretion)）機能集積化、②生理学的パラメータ再現、③マイクロ電気化学センサ集積化 を実現する機能統合型Body-on-a-chipを構築する。 2021年度では、前年度までに開発したマルチウェルプレート型Organs-on-a-chipを用いて、初代培養肝細胞および標的がん細胞の共培養系を確立し、薬効毒性試験を実施した。その機能検討を実施した。この結果、創薬プロセスで従来利用されているコンディションド培地を利用した薬効結果と比して、我々のシステムをOrgans-on-a-chipを利用した結果では、薬効結果に差違が生じることが明らかとなった。機能統合に向けた各要素の改良検討については、スターラ式ポンプの駆動条件を明らかにすると共に、電気化学式グルコースセンサについては、研究分担者の近畿大学小森と共同して改良とその評価を実施し、それぞれの機能の集積化を実現したマルチウェルプレート型のOrgans-on-a-chipの完成に至った。

ヒト応答予測の向上を目指し、酸素非依存性の電気化学バイオセンサでのモニタリングを利用することで、細胞応答を非侵襲で評価するためのシステム開発を検討した。肝細胞については、電気化学グルコースセンサに好気的培養手法を組み合わせることで、生体内の門脈近傍の肝組織と同質の糖代謝・糖新生の現象を電流応答で記述できた。この他にも、アレルギー研究で広く利用される好塩基球様細胞株RBL-2H3が免疫刺激によって遊離するヒスタミンの電気化学モニタリングにも成功している。この手法は、細胞アッセイの予測精度向上に繋がるものと期待される。

本研究では、グラフェン表面からカーボンナノチューブを成長させた３次元ハイブリッド膜（CNTs/G膜）を用いて、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼなどのバイオキャタリストの固定化量を増大させることにより、グラフェンを用いるよりも、高感度な電気化学バイオセンサの構築を試みた。グラフェンと比べて、CNTs/G膜ではバイオキャタリストの固定化量を実際に増大させることが可能であり、基質の過酸化水素に対する触媒還元電流も向上した。したがって、CNTs/G膜を用いることで、グラフェンよりも高感度な電気化学バイオセンサを構築でき、この他にも、酵素を用いたバイオ燃料電池の電極にも利用できるものと期待される。

本研究では、三次元細胞凝集体の大きさを制御し、生体内での主要な毒性発現メカニズムと同質の応答を示す凝集体の最小サイズを明らかにすることを目的とした。マイクロウェル構造を配備したポリジメチルシロキサン(PDMS)テンプレートを作製し、マイクロウェル内でヒト肝ガン細胞株Hep G2の凝集体を形成させた。マイクロウェルの大きさを調節することにより、細胞凝集体の大きさを制御した。薬物代謝酵素シトクロムP450 1A1/2(CYP 1A1/2)の活性を調べたところ、直径200μm・高さ約60μm以上の大きさの凝集体の活性は、直径63μm・高さ約70μmの凝集体のものよりも3. 5倍高くなった。また、CYP 1A1/2に代謝されてより強い毒性を示すアフラトキシンB1(AFB1)を凝集体に暴露したところ、直径200μm以上での凝集体の用量作用曲線は、直径63μmのものよりも1桁低濃度側にシフトした。また、ラット成熟初代肝細胞でも同様の検討を行ったところ、直径110μmの球状の凝集体のAFB1に対する用量作用曲線は、直径35μmの球状のものよりも1桁低濃度側にシフトした。一方、酸素感受性の発光色素白金オクタエチルポルフィリン(PtOEP)をマイクロウェルの底面にコートした、凝集体の呼吸活性を非侵襲的に評価可能なガラス製プレートの開発も試みた。マイクロウェル内で肝ガン細胞株Hep G2の三次元細胞組織を培養したところ、PtOEPの発光強度から、細胞組織の呼吸活性能を評価できた。これらのことから、本方法論を用いることにより、生理学的に同質の応答を示す各種臓器由来の細胞凝集体の大きさを決定できるものと期待される。