2022年より欧米から「原因不明の小児急性肝炎」について多くの報告があがるようになり、アデノウイルスや新型コロナウイルス感染症(COVID-19)流行との関連が疑われている。これまで本邦では小児の急性肝炎のサーベイランスが行われていないことから、今回、日本小児科学会会員が所属する全国の病院小児科責任者を対象に、2017年1月～2022年6月までの期間における同疾患の実態について質問紙調査を行い、947名より回答を得た。その結果、COVID-19流行前の報告数は2017年260名、2018年257名、2019年243名で、COVID-19流行中の報告数は2020年164名、2021年192名、2022年1～6月で113名と、COVID-19流行中の方が少ない傾向がみられた。COVID-19流行前は0歳および1～4歳群の症例数が他の年齢群と比較して多い傾向がみられたが、流行中はこれらの年齢群で減少が著明であった。地域別では、COVID-19流行前・流行後ともに、京都府・愛知県・福島県からの報告が多かった。

BACKGROUND: Part 1 of the DORA study, a 2019 international clinical trial of glecaprevir and pibrentasvir (G/P) treatment in adolescents with chronic hepatitis C virus (HCV) infection, demonstrated high efficacy and safety. However, few reports have considered real-world experience with G/P treatment in adolescents with chronic HCV. The present prospective multicenter study assessed real-world efficacy and safety of G/P treatment in Japanese adolescents with chronic HCV. METHODS: Subjects between 12 and 17 years old who were treatment-naïve or previously managed with interferon-based regimens were prospectively enrolled and treated with G/P (300 mg/120 mg) once daily for 8 or 12 weeks. The primary efficacy endpoint was sustained virologic response at 12 weeks after treatment completion (SVR12). Adverse effects and laboratory abnormalities were assessed. RESULTS: Twenty-five Japanese patients (15 female) were enrolled from 13 pediatric centers in Japan. Median age was 13 years (range 12-17). Numbers of patients with genotypes 1b, 2a, 2b, and 2b/1b were 6, 12, 6, and 1, respectively. Twenty-two were treatment-naïve, while three had experienced interferon-based treatments. All patients completed G/P treatment (24 for 8 weeks and 1 for 12). Twenty-four achieved SVR12 (96%). Most adverse events were mild. None were serious. G/P significantly decreased serum alanine aminotransferase, γ-glutamyltransferase, and Wisteria floribunda agglutinin-positive Mac-2-binding protein concentrations. No negative effects on growth or maturation were apparent at 12 weeks. CONCLUSIONS: Under real-world conditions, G/P treatment of Japanese adolescents with chronic HCV was highly efficacious and well tolerated.

OBJECTIVE: To clarify clinical and genetic features of Japanese children with congenital chloride diarrhea (CCD). STUDY DESIGN: This was a multi-institutional, retrospective survey of 616 pediatric centers in Japan with identified patients with CCD between 2014 and 2018. Mutations involving SLC26A3 were detected by Sanger sequencing. RESULTS: Thirteen patients met all entry criteria including mutations in SLC26A3, and 14 patients satisfied clinical diagnostic criteria. Homozygous or compound heterozygous mutations in SLC26A3, including 6 novel mutations, were identified in 13 of these 14 patients (93%). The most common (detected in 7 of 13) was c.2063-1g>t. Median age at diagnosis was 1 day. Nine of the patients meeting all criteria were diagnosed as neonates (69%). Median follow-up duration was 10 years. When studied, 8 patients had <5 stools daily (62%), and all had fewer than in infancy. Only 1 patient had nephrocalcinosis, and 3 (23%) had mild chronic kidney disease. Neurodevelopment was generally good; only 1 patient required special education. Five patients (38%) received long-term sodium, potassium, and chloride supplementation. CONCLUSIONS: Early fetal ultrasound diagnosis and prompt long-term sodium, potassium, and chloride supplementation were common management features. Genetic analysis of SLC26A3 provided definitive diagnosis of CCD. In contrast with previously reported localities, c.2063-1g>t might be a founder mutation in East Asia.

BACKGROUND: Shwachman-Diamond syndrome (SDS) is a rare multisystem disorder associated with exocrine pancreatic insufficiency. The present study reports the results of a nationwide survey and a systematic review on SDS to develop consensus guidelines for intractable diarrhea including SDS. METHODS: Questionnaires were sent to 616 departments of pediatrics or of pediatric surgery in Japan in a nationwide survey. A second questionnaire was sent to doctors who had treated SDS patients and included questions on clinical information. Additionally, a systematic review was performed using digital literature databases to assess the influence of medical (i.e. non-surgical) treatment on SDS prognosis. RESULTS: Answers were received from 529 institutions (85.9%), which included information on 24 patients with SDS (median age, 10.4 years; male, n = 15) treated from January 2005 to December 2014. Although 75% of patients received pancreatic enzyme replacement therapy, there was no significant association between treatment and prognosis. Systematic review identified one clinical practice guideline, two case series, eight case reports and 26 reviews. Patient information from those studies was insufficient for meta-analysis. CONCLUSIONS: The rarity of SDS makes it difficult to establish evidence-based treatment for SDS. According to the limited information from patients and published reports, medical treatment for malabsorption due to SDS should be performed to improve fat absorption and stool condition, but it is not clear whether this treatment improves the prognosis of malabsorption.

AIM: The molecular mechanisms by which hepatocyte nuclear factor (HNF)4α regulates fetal liver development have not been fully elucidated. We screened the downstream molecules of HNF4α during liver development and identified sodium-coupled neutral amino acid transporter (SNAT)4. The aim of this study is to investigate the regulation of SNAT4 by HNF4α and to clarify its roles in differentiating hepatocytes. METHODS: HNF4α was overexpressed in cultured liver buds using adenovirus, and suppression subtractive hybridization screening was performed. Temporal and spatial expression of SNAT4 during liver development was investigated. Regulation of SNAT4 by HNF4α was examined by promoter analyses and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). Metabolic labeling and western blotting were carried out using primary hepatoblasts with SNAT4 overexpression. RESULTS: The expression of Slc38a4 encoding SNAT4 showed a marked perinatal increase, and was predominant among system A amino acid transporters. It was first detected in embryonic day 18.5 liver, and found in most hepatocytes after birth. Three alternative first exons were found in the SNAT4 gene. Promoter analyses using approximately 3-kb fragments corresponding to each first exon (AP1, AP2, AP3) revealed that AP1 and AP2 exhibited strong promoter activity in mouse hepatoblasts with endogenous HNF4α. Transactivation of AP2 was upregulated by HNF4α in HeLa cells without endogenous HNF4α. EMSA has demonstrated that HNF4α directly binds to cis-elements in AP2. Overexpression of SNAT4 facilitated amino acid uptake and de novo protein synthesis in primary hepatoblasts. CONCLUSION: SNAT4 functions downstream of HNF4α and plays significant roles in liver development through mechanisms of amino acid uptake and protein synthesis.

Although LT can be successful for treating end-stage liver disease in children, some patients develop fibrosis around the central vein area (PCF). This raises the possibility that PCF could lead to later cirrhosis and graft failure. Here, we report a retrospective immunohistochemical study of 28 patients who received a live donor liver transplant. We assessed the incidence and etiology of PCF using CD3, CD20, HLA-DR, and C4d-specific antibodies. Histological evidence of PCF was found in 13 cases (46.4%), of which 11 (84.6%) had experienced ACR and/or CP events post-transplant. Immunohistochemical evaluation revealed significantly stronger staining with these antibodies in the central vein area in PCF, especially for CD20 and C4d. This implies humoral immunopathology and suggests involvement of humoral immunity in the development of PCF. These results further imply that suppression of cellular immunity alone is insufficient to prevent PCF. We therefore suggest that suppression of both humoral and cellular immunity in combination would be required for prevention of PCF.

AIM:   Hepatic steatosis accompanied by impaired protein synthesis is often observed in hepatic dysfunction. To assess whether protein synthesis inhibition directly induces hepatic steatosis, we investigated the molecular mechanisms of cycloheximide (CHX)-induced fatty liver mice. METHODS:   C57/BL6CR mice were i.p. administrated CHX (20 mg/kg) three times every 4 h to induce hepatic steatosis. Hepatic lipid secretion, fatty acid oxidation, hepatic lipogenesis and hepatic lipid uptake were evaluated. RESULTS:   Twenty-four hours after the first CHX injection, hepatic lipid levels increased in CHX-treated mice to 1.8-fold of that in controls but returned to normal within 48 h. The hepatic triglyceride (TG) secretion rate decreased significantly to 22% of controls, and the apolipoprotein B (apoB) protein level, but not microsomal TG transfer protein, decreased in CHX-treated mice. The apob gene expression was not significantly different between controls and CHX-treated mice. On the other hand, plasma free fatty acid and lipogenic protein levels did not increase and plasma β-hydroxybutyrate level remained stable, suggesting that the coordinated balance between fatty acid oxidation, hepatic lipid uptake and lipogenesis was not disrupted in this model. Cellular lipid accumulation and decreased cellular and secreted apoB were also observed in CHX-treated HepG2 cells. Knockdown of apoB in HepG2 cells also resulted in the cellular TG accumulation. CONCLUSION:   We demonstrated that decreased hepatic lipid secretion due to acute apoB reduction is involved in the pathogenesis of CHX-induced liver steatosis.

We present a 6-year-old boy with a virilizing adrenocortical tumor who initially presented with peripheral precocious puberty. Development of facial acne, pubic hair and a growth spurt were noted at the age of five. A low-pitched voice as well as maturation of external genitalia was noted at the age of six. Both serum and urinary levels of adrenal androgens were elevated. Abdominal computed tomography revealed a large right suprarenal mass and he underwent surgical resection without any complications. The histological diagnosis was adrenocortical carcinoma according to the criteria of Weiss. Following surgical removal of the androgen-producing tumor, the patient subsequently developed hypothalamic-pituitary activation and demonstrated central precocious puberty. He was treated with a gonadotropin-releasing hormone agonist in order to delay further pubertal progression. Clinical follow-up of potential secondary effects of excess hormone secretion after removal is important in some pediatric patients with virilizing adrenocortical tumor.

Wnt/beta-catenin signaling has been implicated in repressing adipogenesis. Several lines of evidence show that the possible mechanism is blockade of PPARgamma induction. However, the precise mechanisms remain to be elucidated. In this study, we demonstrated that Wnt3a conditioned medium suppresses C/EBPbeta/delta-induced adipogenesis of 3T3-L1 cells by inhibiting PPARgamma induction. In addition, the mutual activation of PPARgamma and C/EBPalpha was also repressed in the presence of Wnt3a. To further investigate the role of the canonical Wnt pathway in adipogenesis, we used mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from Lrp6-deficient embryos. Contrary to wild-type MEFs, Lrp6-deficient MEFs showed spontaneous adipogenesis and escaped the suppressive effect of exogenous Wnt3a. These findings suggest a critical role of Wnt/Lrp6/beta-catenin signaling in adipogenesis and cell fate decision of mesenchymal stem cells.

小児腫瘍性疾患の治療終了後2年以上経過した108名(男52名・女56名・平均17.2歳)を対象に晩期障害を調べた。原疾患の内訳は血液腫瘍58名、脳腫瘍25名、固形腫瘍25名で、治療内容は化学療法102名、外科的治療52名、放射線療法65名、移植56名であった。晩期障害としては、性腺機能低下症57名、成長障害37名、甲状腺機能低下症26名、肥満21名、中枢性尿崩症10名、副腎皮質機能低下症9名を認めた。ホルモン補充療法が行われていたのは、成長ホルモン13名、性腺補充療法26名、甲状腺ホルモン21名、副腎皮質ステロイド9名、DDAVP点鼻10名であった。成長障害の原因は、成長ホルモン分泌不全性低身長症以外に、原疾患の治療中に生じた成長障害からcatch upできていない患者、脊椎へ放射線照射を受けた患者、思春期年齢に原疾患の治療が重なった患者など、様々な要因があった。内分泌学的問題点の他にも、脳腫瘍治療後患者を中心に多くの問題点を認めた。

Persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy (PHHI) is often resistant to medical therapy and is normally treated by subtotal pancreatectomy to avoid neurological complications. However, many problems after surgery, such as recurrence of hypoglycemia and diabetes mellitus, remain to be solved. This report concerns a case of PHHI that was resistant to octreotide or diazoxide alone but was successfully controlled with subcutaneous injection of octreotide in combination with nocturnal glucose infusion through central venous catheter. The patient exhibited natural remission of hyperinsulinism with age, and all treatment was ceased at the age of 4 yr. Growth and neurological development of the patient have been normal. This combined therapy can be a therapeutic option as a substitute for surgical solutions.

Haploinsufficiency of the short stature homeobox-containing (SHOX) gene causes Turner skeletal features, a certain proportion of idiopathic short stature and Leri-Weill dyschondrosteosis (LWD). Here we report a Japanese female with LWD. Her physical growth, skeletal deformity, and endocrine status were recorded longitudinally. She exhibited a constant growth rate (average + 6.2 cm/yr) from 6 to 9 yr old, followed by a downward shift at 10 yr old. Her final height was 135 cm (-4.4 SD for an adult female) and weight was 50.5 kg (-0.3 SD) at 12 yr and 10 mo old. Mesomelia and cubitus valgus were noticed from 2 yr old, and metaphyseal lucency and epiphyseal hypoplasia of the medial side of the distal radius were detected at 6 yr old. Madelung deformity was obvious at 10 yr old, when menarche occurred. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis demonstrated a single copy of the SHOX gene. The short stature of the patient was thought to be exaggerated by the combination of SHOX haploinsufficiency and relatively early puberty.

We report a case of Japanese girl with a rare disorder of Weaver syndrome, which was characterized by overgrowth with advanced and disharmonic bone age, craniofacial abnormalities, developmental delay, metaphyseal flaring of the long bones and camptodactyly. The patient was delivered at 38 weeks of gestation with a length of 54.2 cm (+ 2.6 SD), a weight of 3805 g (+ 2.5 SD) and an occipitofrontal circumference (OFC) of 35.0 cm (+ 1.1 SD). She manifested hypertonia and flexion contractures in the first few years. She also had submucosal soft cleft palate and difficulty in swallowing and breathing in early infancy. When she was 5 years and 7 months old, her height and weight were 133.3 cm (+ 5.5 SD) and 32.0 kg (+ 5.1 SD), respectively. We could not detect any endocrinological abnormalities for the cause of overgrowth. According to clinical features, Weaver syndrome was suspected and genetical analysis was performed. Fluorescence in situ hybridization (FISH) and direct sequencing analysis showed neither deletion nor point mutation of the nuclear receptor SET-domain-containing protein 1 (NSD1) gene on 5q35, which is responsible for Sotos syndrome. Therefore, we made a diagnosis of Weaver syndrome for this patient and discussed the differential diagnosis in terms of overgrowth syndrome.

BACKGROUND/AIMS: Thrombospondin-1 is a major activator of transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1), and a peptide derived from the latency-associated peptide, Leu-Ser-Lys-Leu (LSKL), inhibits the activation of TGF-beta1. In this study, the effects of LSKL on the hepatocyte damage and fibrogenesis in dimethylnitrosamine (DMN)-induced rat liver fibrosis were examined. METHODS: Animals were given an intraperitoneal (i.p.) injection of DMN or saline three times per week for 4 weeks, and treated with LSKL, a control peptide, or saline i.p. daily. RESULTS: Liver atrophy caused by DMN-injection was significantly inhibited in the DMN+LSKL group. The degrees of necrosis/degeneration and fibrosis scores were significantly lower in the DMN+LSKL group than in the control groups. The hydroxyproline content was significantly higher in the control groups than in the DMN+LSKL group. The amount of active TGF-beta1 was less in the DMN+LSKL group than in the control groups, and the active/total TGF-beta1 ratio in the DMN+LSKL group was suppressed in the control groups. Phosphorylation of Smad 2 in the liver was significantly decreased in the DMN+LSKL group. CONCLUSIONS: The LSKL peptide prevented the progression of hepatic damage and fibrosis through the inhibition of TGF-beta1 activation and its signal transduction in vivo.

当施設では開設時より院内・院外出生を問わず可能な限り胎盤を入手しその肉眼的・組織学的所見を記録・保存してきた.今回主要新生児外科疾患について, 各々に特異な周産期情報や胎盤所見を認め得るのか検討した.1981年から1995年の間に当科で経験した主要新生児外科症例中, 胎盤所見が保存されている240症例(横隔膜ヘルニア45例・腹壁破裂29例・臍帯ヘルニア36例・直腸肛門奇形62例・十二指腸閉鎖を含む小腸閉鎖症50例・食道閉鎖症34例・胎便性腹膜炎10例)を対象とし, 同時期の正期産児登録症例から対象疾患群に属する症例を除いた16, 627例を対照として比較した.前期破水は直腸肛門奇形と小腸閉鎖症で, 羊水混濁は腹壁破裂と小腸閉鎖症で高率であった.胎盤重量は食道閉鎖症と直腸肛門奇形で小さかった.臍帯径は横隔膜ヘルニアで小さく, 臍帯ヘルニアと腹壁破裂で大きかった.臍帯の付着異常は直腸肛門奇形と食道閉鎖症で, 臍帯の色調異常は腹壁破裂と臍帯ヘルニアで高率であった.単一臍帯動脈は直腸肛門奇形で多く, 肉眼的胎児面感染疑い・メコニウム沈着は腹壁破裂で多かった.母体側炎症を反映する絨毛膜羊膜炎は腹壁破裂で多く, 胎児側炎症を反映する臍帯炎の頻度は胎便性腹膜炎で高かった.臍帯ヘルニア・食道閉鎖症で認められた胎盤所見の特徴が18トリソミーなど重篤な染色体異常合併による影響かと疑ったが, これを除いても同様の傾向を認めた.各々の異常所見すべてが各疾患に特異なものかは今後の検討を要するが, 腹壁破裂や胎便性腹膜炎において胎盤の炎症所見を多く認めたことはその病態を考える上で重要な所見と思われた.

肝発生過程におけるHNF4α下流分子のスクリーニングを行い、中性アミノ酸トランスポーターSNAT4を同定した。SNAT4はmRNAレベルにおいて他のSNATファミリー分子に比べ優位に発現し、免疫組織化学では出生前のE18.5日に発現し出生後は全ての肝細胞で発現を認めた。SNAT4に3つの新規の選択的プロモーターを同定し、HNF4αによる直接制御を証明した。初代培養肝芽細胞にSNAT4過剰発現によりde novo蛋白合成が増加し、特にレチノール結合蛋白(RBP)1が増加した。そのmRNAはむしろ低下していたことから、この増加は翻訳レベルであることが示唆された。

小児難治性肝疾患によって生じた硬変肝におけるGrb10の発現と局在について検討し、さらにin vitroでの検討を進めるために動物肝障害モデルでの発現の変化と局在についての研究を行った。DMN、およびCCl4投与モデルマウスを既成のプロトコールに基づいて作成した。しかしながらいずれも投与量依存性にマウスの致死率が高く、低投与量群を設定して長期投与実験を行ったが、結果的に検討に供しうる肝硬変には至らなかった。そこで、総胆管結紮(CBDL)による肝硬変モデルに変更し、抗Grb10抗体にて免疫染色を行ったところ、領域特異的な染色像は得られなかった。一方、RT-PCRではDMN、CBDLマウス肝と同様に成体正常マウスでもGrb10の発現が認められ、発現量に明らかな差を認めず、マウスにおけるGrb10の発現は胎生期の肝で認められるものの成体では非常に低いとする過去の報告と異なっていた。一方、Western blotでは成体肝では蛋白発現がなく、胎仔肝とCBDL肝で発現していることが確認された。 次に、ラット肝星細胞(HSC)を単離、myofibroblastへの形質変化を確認し、これと肝細胞におけるGrb10の発現をRT-PCRにより検討した。その結果、肝細胞では発現がみられず、myofibroblast (HSC)でGrb10 mRNAが発現していることが確認された。 ここまでの検討より、マウスにおけるGrb10の正常肝、および傷害線維化肝における発現は、必ずしもヒトの病態を検討するに相応しい局在を有さない可能性が考えられた。一方、ラットではDMN線維化モデルにおいてヒトと相同なGrb10 mRNAの局在が確認された。ラットHSCを用いた培養系における実験環境はヒトの病理病態を完全に反映するものではないが、今後の肝線維化におけるGrb10の役割の検索を進める対象となりうると考えられた。

仮説と目的 障害を受けた未熟損傷肺に対して、潜在型TGF-β活性化拮抗オリゴペプチド(LSKL)を投与することによって、TGF-βの活性を抑制し肺線維化を軽減できるのではないかとの仮説をたてた。14年度は、ブレオマイシンによる肺線維化モデルラットをもちいて、LSKLを吸入により投与し、1)2週間後の体重増加の比較、2)肺コンプライアンスの比較、3)肺実質のヒドロキシプロリン量の比較、において、いずれもLSKL群が生食群に比較して、肺線維化を軽減し、損傷を抑制することを明らかにした。15年度はこのモデルにおいて、TGF-β活性化が実際に抑制されているかどうか検討した。 方法 4週齢のSDラットの気管内にブレオマイシン(15mg/kg body weight)を投与し、肺線維化モデルを作成し、生食またはLSKLをチャンバー内で30分間、吸入させ、day1,day3.day7の肺実質のactiveTGF-β/total TGF-β比を比較した。(各N=1〜3)。 結果 day1,day3.day7の肺実質のactiveTGF-β/total TGF-β比は、生食群では、1.61,1.65,1.92 LSKL群では、0.90,1.50,1.11であり、LSKLの吸入によって、TGF-βの活性化が抑制された可能性が示唆された。 結論 一連の結果より、LSKLの吸入による投与は、このモデルにおいて、TGF-βの活性化を抑制し、線維化を軽減し、生理学的なパラメータを改善した。今後は、臨床応用を目指し、投与方法や安全性等検討したい。

1.DMN投与によるラット肝障害モデルにおけるLSKLペプチド腹腔内投与の有効性についての検証:昨年度に行った、肝細胞におけるTGF-β1活性化抑制に伴うSmad2リン酸化シグナル低下の検証をデータとして追加し、J.Hepatolに投稿。同誌39(2003)742-743に掲載された(Title : A blocking peptide for transforming growth factor-β1 activation prevents hepatic fibrosis in vivo.)。 2.LSKLの経胃投与モデルによる肝障害抑制効果の検討:DMN肝障害ラット体重100gあたり1mg(腹腔内投与量の約10倍量)のLSKLを2週間経胃投与を行った。2週間後の体重、肝組織中ヒドロキシプロリン量、および肝組織像での評価を行ったが、LSKLの経胃投与群と対照群との間に有意な差は認められず、LSKLの経胃投与での有効性は認められいとの結果を得た。その原因として生体材料との混和により本テトラペプチドが速やかに分解されてその活性を失うことが考えられた。 3.LECラットに対するLSKLペプチド投与による発癌抑制効果の検討:肝障害・発癌モデルとしてのLECラット(20週齢)に対してペプチドの長期経口投与実験(56週間、76週齢まで)を行った。その結果、LSKL投与群(n=3)のうち1匹が56週投与終了まで生存し、2匹は投与6週、46週で死亡した。SLLK群(n=2)は投与2週、18週で死亡し、飼育水のみの群(n=2)は1匹が投与終了まで生存し、1匹は投与5週で死亡した。LSKL、および飼育水で投与終了まで生存した2匹の肝には、いずれも結節状の癌腫瘤が多発しており、本実験系においてはLSKL投与による慢性肝障害予防あるいは発癌抑制効果信認められなかった。 <総括>本研究により、LSKLが肝障害および線維化の進行をTGF-β活性化抑制機序により有意に抑制することが検証されたが、生体材料との接触によって容易に分解されてしまうためにペプチドの経口投与は有効でないことが明らかとなった。今後、肝疾患への臨床適用のためには、本ペプチドの生理活性の有機化合物化が必要と考えられる。あるいは、肺線維症に対する吸入投与などの異なった臓器に対する異なった投与経路での適用に期待が持たれる。

1.正常小児におけるTTウイルス(TTV)の感染率を検討した。N22のプライマーによる検討では、0-15歳までの正常小児114例のTTV陽性率は、33例、28.9%であり、7歳以降に加齢とともに急に上昇したが13歳以降は明らかに低下した。 2.TTVのnon-coding regionの塩基配列を調べ、系統樹解析を行うことによって母子4組においてTTVの母子感染の確認が可能であった。 3.小児の非A-非G型肝炎患者41例においてTTVの検出を試みた。N22のprimerを用いたPCRでは、非A-非G型肝炎患児の31.7%が陽性であり、正常小児114名のTTV陽性率28.9%と比べて有意差はなかった。TTV陽性の肝炎13例におけるgenotypeは、genotype1が11例、genotype2が2例であり、正常小児(33例中genotype1が30例、genotype2が3例)と比べて有意差を認めなかった。 4.胆汁うっ滞が遷延し、体重増加不良などの症状が認められた血清TTV陽性の新生児肝炎3例において、大量ガンマグロブリン療法後に血清総胆汁酸の著明な低下とともに体重増加の改善が認められた。肝組織のTTVDNAが陽性であり、治療後に血清からTTVDNAが消失した。このように一部の新生児肝炎の発症にTTV感染が関与している可能性がある。

平成11年度の研究において、我々はラット小型肝細胞の長期間培養用に考案された培地(1996,Tateno et al.)にFe、Zn、Cuを添加し、8週間以上にわたって肝細胞由来の形質を維持して培養可能な培地条件を決定した。本培地でラット肝細胞の初代培養を行い、4〜8週間にわたって培養細胞が肝細胞マーカー(CK8,AFP,Albumin)を安定して発現しており、そのうち一部の細胞が胆管上皮系のマーカーであるCK19を発現することを確認した。このCK19の発現陽性率は培養期間とともに変化し、培養開始から1週間目に20%、2週間目に25%、3週間目に33%、4週間目には41%に増加した。 このラット培養肝細胞の経時的形質変化に伴うJagged1mRNAの発現およびその変化について検討を行っている。この検討においてもRT-PCRレベルでは発現が確認されるが、northern blotではシグナルは検出されなかった。これについてはより感度の高い検出方法としてRNase protection assay、あるいはin situ hybridizationで検討する必要があるが、現時点ではまだ試行できていない。 一方、我々は先年よりの研究においてthrombospondin-1(TSP)が胆道閉鎖症の線維化肝に高発現していることを示し、TSPおよびTGF-βとその受容体の病理組織中での局在から、肝の病理においてTSPがTGF-βの活性化を介して偽胆管増生および線維化に促進的な役割を果たしている可能性を示して報告した(AmJ Pathol,in revise)。これに基づいて上記の培養系においてTGF-β(10ng/ml)を培地に添加して培養肝細胞の形質変化を観察したところ、4週目までのCK19の発現陽性率が対照群に比して増加し、CK18およびalbuminの発現強度の増加が認められた。現在、TSPが潜在型TGF-βの主要な活性化因子であることに着目し、その活性化ドメインに拮抗する抑制ペプチドを上記培養系に添加、あるいは発現させることによりCK19の発現率に変化が見られるかどうかについて実験を進めている。

生体肝移植を受けた胆道閉鎖症の患児に認められた高度線維化(F)部と非線維化 (N)部よりそれぞれ抽出したmRNAを用いてdifferential RT-PCRを行い、これまでにトロンボスポンジン(TSP)、補体4a(C4a)、成長因子受容体結合蛋白の一種と見られる蛋白(Grb-IR-1ike protein)、および鉄調節因子結合蛋白などのmRNAがN部よりF部において有意に高発現していることを確認した。Grb-IR-LPについては、当初サブクローニングした3'-noncoding regionの上流塩基配列を検討したところ、昨年クローニングされたGrb-IRのalternative splice variantの一つであるGrb-IRγであることが確認された。Grb-IRγは正常な肝組織には殆ど発現が認められないが、我々が行ったin situ hybridizationによる検討では、F部の線維化をきたした門脈域の線維芽細胞に強い発現が確認され、この蛋白がチロシンキナーゼ型受容体の細胞内リン酸化部位への結合蛋白として肝の線維化に促進的な役割を担っている可能性が示唆された。またTSPについては、我々は複数例の肝病理組織においてそのmRNAが細胆管周囲の線維芽細胞に発現し、蛋白が線維化部の増生細胆管周囲に分泌されていることを確認したが、近年の知見では、個体発生においてTSPが組織内の潜在型TGF-β1を活性型へと転換させることによって器官形成に関与していることが明らかとなっている。そこで我々は、さらに同様の病理組織におけるTGF.βとその受容体の局在についても検討し、器官形成だけでなく病理学的な線維化局面においてもTSPがTGF-βとの関連において機能している可能性を示した。上記Grb-IRγおよびTSPに関する検討については、それぞれ論文として投稿中である。

ビタミンD応答配列(VDRE:vitaminn D response element)の機能を理解する上で、chick副甲状腺ホルモン遺伝子等でみられるDR3型のnVDRE(negative VDRE)が、正の応答性を示すVDREと構造が類似しているにもかかわらず応答が異なる機序を検討する必要がある。前年度は、DR3型nVDREのビタミンD応答性を検討したが、ビタミンD添加群は非添加群の85%程度の活性を示し、用いたnVDREの負の応答性が不十分であると判断されたので、今年度は、より負の応答性が明瞭な遺伝子プロモーターを得ることを目的として、ヒト1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのクローニングを行った。BAC(bacterial artificial chromosome)system "Down to the Well BAC Human DNA Pools"(Genome SYstems Ins,)を用いて、既報告の塩基配列を利用してprimerを合成し、PCR screeningを行い、1αOHaseの上流を含んでいると思われるBAc cloneを決定した。1αOHase遺伝子を含む上流約3Kbpを切り出し、pGEM3zfにsubcloningした。その後、luciferaseをリポーターとするベクターに組込み、subcloningした1αOHase遺伝子5'上流域がプロモーター活性を持つことを確認した。COS細胞にビタミンD受容体(VDR)発現ベクターともに導入したが、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのビタミンDの応答性は認められなかった。ビタミンD応答性が細胞特異的である可能性があるので尿細管細胞を用いる必要がある。また、VDRの導入のみでプロモーター活性の低下が認められたので、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーター活性の負の制御が、リガンド非存在下でみられる可能性が考えられた。