Ultrasound neuromodulation has become an innovative technology that enables noninvasive intervention in mammalian brain circuits with high spatiotemporal precision. Despite the expanding utility of ultrasound neuromodulation in the neuroscience research field and clinical applications, the molecular and cellular mechanisms by which ultrasound impacts neural activity in the brain are still largely unknown. Here, we report that transient receptor potential canonical 6 (TRPC6), a mechanosensitive nonselective cation channel, is essential for ultrasound neuromodulation of mammalian neurons in vitro and in vivo. We first demonstrated that ultrasound irradiation elicited rapid and robust Ca ²⁺ transients mediated via extracellular Ca ²⁺ influx in cultured mouse cortical and hippocampal neurons. Ultrasound-induced neuronal responses were massively diminished by blocking either the generation of action potential or synaptic transmission. Importantly, both pharmacological inhibition and genetic deficiency of TRPC6 almost completely abolished neuronal responses to ultrasound. Furthermore, we found that intracerebroventricular administration of a TRPC6 blocker significantly attenuated the number of neuronal firings in the cerebral cortex evoked by transcranial ultrasound irradiation in mice. Our findings indicate that TRPC6 is an indispensable molecule of ultrasound neuromodulation in intact mammalian brains, providing fundamental understanding of biophysical molecular mechanisms of ultrasound neuromodulation as well as insight into its future feasibility in neuroscience and translational research in humans.

Dysregulated fear reactions can result from maladaptive processing of trauma-related memories. In post-traumatic stress disorder (PTSD) and other psychiatric disorders, dysfunctional extinction learning prevents discretization of trauma-related memory engrams and generalizes fear responses. Although PTSD may be viewed as a memory-based disorder, no approved treatments target pathological fear memory processing. Hippocampal sharp wave-ripples (SWRs) and concurrent neocortical oscillations are scaffolds to consolidate contextual memory, but their role during fear processing remains poorly understood. Here, we show that closed-loop, SWR triggered neuromodulation of the medial forebrain bundle (MFB) can enhance fear extinction consolidation in male rats. The modified fear memories became resistant to induced recall (i.e., ‘renewal’ and ‘reinstatement’) and did not reemerge spontaneously. These effects were mediated by D2 receptor signaling-induced synaptic remodeling in the basolateral amygdala. Our results demonstrate that SWR-triggered closed-loop stimulation of the MFB reward system enhances extinction of fearful memories and reducing fear expression across different contexts and preventing excessive and persistent fear responses. These findings highlight the potential of neuromodulation to augment extinction learning and provide a new avenue to develop treatments for anxiety disorders.

Although the etiology of major depressive disorder remains poorly understood, reduced gamma oscillations is an emerging biomarker. Olfactory bulbectomy, an established model of depression that reduces limbic gamma oscillations, suffers from non-specific effects of structural damage. Here, we show that transient functional suppression of olfactory bulb neurons or their piriform cortex efferents decreased gamma oscillation power in limbic areas and induced depression-like behaviors in rodents. Enhancing transmission of gamma oscillations from olfactory bulb to limbic structures by closed-loop electrical neuromodulation alleviated these behaviors. By contrast, silencing gamma transmission by anti-phase closed-loop stimulation strengthened depression-like behaviors in naive animals. These induced behaviors were neutralized by ketamine treatment that restored limbic gamma power. Taken together, our results reveal a causal link between limbic gamma oscillations and depression-like behaviors in rodents. Interfering with these endogenous rhythms can affect behaviors in rodent models of depression, suggesting that restoring gamma oscillations may alleviate depressive symptoms.

The medial septum (MS), as part of the basal forebrain, supports many physiological functions, from sensorimotor integration to cognition. With often reciprocal connections with a broad set of peers at all major divisions of the brain, the MS orchestrates oscillatory neuronal activities throughout the brain. These oscillations are critical in generating sensory and emotional salience, locomotion, maintaining mood, supporting innate anxiety, and governing learning and memory. Accumulating evidence points out that the physiological oscillations under septal influence are frequently disrupted or altered in pathological conditions. Therefore, the MS may be a potential target for treating neurological and psychiatric disorders with abnormal oscillations (oscillopathies) to restore healthy patterns or erase undesired ones. Recent studies have revealed that the patterned stimulation of the MS alleviates symptoms of epilepsy. We discuss here that stimulus timing is a critical determinant of treatment efficacy on multiple time scales. On-demand stimulation may dramatically reduce side effects by not interfering with normal physiological functions. A precise pattern-matched stimulation through adaptive timing governed by the ongoing oscillations is essential to effectively terminate pathological oscillations. The time-targeted strategy for the MS stimulation may provide an effective way of treating multiple disorders including Alzheimer's disease, anxiety/fear, schizophrenia, and depression, as well as pain.

Temporal lobe epilepsy with distributed hippocampal seizure foci is often intractable and its secondary generalization might lead to sudden death. Early termination through spatially extensive hippocampal intervention is not feasible directly, because of the large size and irregular shape of the hippocampus. In contrast, the medial septum is a promising target to govern hippocampal oscillations through its divergent connections to both hippocampi. Combining this ‘proxy intervention’ concept and precisely timed stimulation, we report here that closed-loop medial septum electrical stimulation can quickly terminate intrahippocampal seizures and suppress secondary generalization in a rat kindling model. Precise stimulus timing governed by internal seizure rhythms was essential. Cell type-specific stimulation revealed that the precisely timed activation of medial septum GABAergic neurons underlaid the effects. Our concept of time-targeted proxy stimulation for intervening pathological oscillations can be extrapolated to other neurological and psychiatric disorders, and has potential for clinical translation.

PURPOSE: This study investigated the potential of collagen-coated polyglycolic acid (PGA) tube with interpositional jump graft (IPJG) in rat. MATERIALS AND METHODS: A total of 16 Lewis rats were used in this study. Facial nerve paralysis was created by ligating facial nerve trunk with a ligature clip. The rats were divided into 3 groups. Nerve conduit group (n = 6) were treated by IPJG with collagen-coated PGA tubes between the facial nerve trunks and the hypoglossal nerves. Autograft group (n = 6) were treated by IPJG with the greater auricular nerves. As the control group (n = 4), non-treated-model rats with facial nerve paralysis were used. The number of myelinated fibers, fiber diameter, axon diameter, myelin thickness, and g-ratio, were analyzed histologically at 13 weeks after surgery. Compound muscle action potential (CMAP) and retrograde tracing were measured. RESULT: Although the number of myelinated fibers in autograft group (1957 ± 775) had significantly higher than that of nerve conduit group (90 ± 41, P < .05), the nerve conduit group showed the regeneration of myelinated nerve axons. CMAP amplitude values of the autograft (4706 ± 1154 µV) and the nerve conduit groups (4119 ± 1397 µV) were significantly higher than that of the control group (915 ± 789 µV, P < .05). Retrograde tracing confirmed the double innervation of mimetic muscles by the facial and hypoglossal nucleus in both groups. CONCLUSION: This study showed histologically and physiologically the superior effectiveness of performing IPJG with a collagen-coated PGA conduit in a rat model.

Medical Science Digest 46 (6): 906-909, 2020.

Medical Science Digest 46 (2): 118-121

Clin Neurosci 29 (8): 895-899.

難治性てんかんの根治のためには脳内の発作感受性の消去が必要である。最近研究代表者らは、発作間欠期脳活動を用いた発作感受性の解読および定量化に成功し、さらにモデル動物において時空間特異的かつ細胞種特異的な深部脳領域刺激で発作感受性の低減・消去可能と見出した。しかしながら当該知見の応用には電極や光カニューラの脳実質への刺入に伴う侵襲性が課題である。一方、既存の非侵襲的脳刺激法は、深部到達性・空間特異性の不足あるいは細胞種特異性の欠如いずれかが課題である。そこで本研究は、非侵襲性、深部到達性、時空間特異性、および細胞種特異性を全て兼ね備えた新規脳深部刺激法の開発による上記課題の解決を目的とした。当該新規脳刺激法と非侵襲的遺伝子導入法の融合により、革新的なてんかんの根治療法を創出する。さらにヒト頭皮上脳波から発作感受性を定量する手法の開発にも挑む。 初年度は、まずげっ歯類の頭蓋上にも留置可能なほど小型な集束超音波照射装置のプロトタイプを新規に作出するとともに、バクテリア由来の機械受容チャネルをげっ歯類の大脳に強制発現することで頭蓋外から非侵襲的に照射した超音波で大脳神経細胞の活動を制御する技術の開発に成功した。さらに共同研究により、哺乳類大脳における超音波ニューロモデュレーションに関わるイオンチャネルを新規に同定した。また健常ボランティアにおいて、頭皮上脳波記録を行う計測系を新たに立ち上げた。

薬物抵抗性脳疾患の制御には、神経活動の直接操作や遺伝子治療が有効である。これまで光遺伝学的神経活動操作で脳疾患モデル動物の症状を制御する研究が多く行われてきた。しかしながら光遺伝学的神経活動操作法には光ファイバーの脳実質への刺入が必要であるため、臨床応用にはその侵襲性が大きな課題であった。 また近年脳疾患を含む遺伝病の治療法としてゲノム編集技術が着目されている。現在の治療戦略はウイルスベクターの全身投与あるいは脳実質への直接投与であるため、空間特異性の欠如あるいは侵襲性がそれぞれ課題である。 そこで本研究では、経頭蓋集束超音波照射法と超音波細胞膜穿孔（ソノポレーション）法およびゲノム編集法の融合により、頭蓋外から非ウイルス性に脳部位特異的な遺伝子導入あるいはゲノム編集を可能にする経頭蓋遺伝子操作法の創出によって、これらの課題を克服することを目的とする。 初年度は、まず経頭蓋集束ソノポレーション法に関して1-10 MHzの中心周波数を検討し、周波数依存的に遺伝子導入の空間的範囲を制御できることを見出した。次に複数の機械受容チャネル分子に関して、そのプラスミド分子の静脈経由および経頭蓋集束超音波照射を組み合わせることで、任意の脳部位に遺伝子導入が可能であることを見出した。さらに培養細胞において、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドを用いたゲノム編集技術を評価する実験を立ち上げた。

反復社会的敗北ストレスを経験したマウス（cSDS）では、雌雄選択試験において、異性に対する接触時間が、対照群マウスと比較して短くなっており、アンヘドニア（無快楽状態）となったと言える。そこで、このcSDSマウスにおける複数の脳領域における活動を自由行動下にて同時に記録するため、ラットで行われている広範囲多点脳活動同時記録を応用し、マウスで実施し、昨年度までに、腹側被蓋野（VTA）、海馬、帯状回皮質における脳活動を同時に計測することに成功したが、今年度では、島皮質、一次体性感覚野、二次体性感覚野での記録についても成功することができた。一方で、この脳活動計測を長期で行うために、計測条件を検討したが、1ヶ月までの長期計測は達成には到達できなかった。次に、GRINレンズを海馬へ埋植した後に、Miniscopeを用いて蛍光イメージングを行った結果、神経細胞（海馬）の活動を、自由行動下の動物から記録できた。アデノ随伴ウィルスベクター（AAV）を用いて、GCaMP6sを神経細胞へ発現させたところ、GRINレンズを用いたMiniscopeによる蛍光イメージングを実施することができ、神経活動を記録することができた。人工化合物により活性化されるデザイナー受容体を、特定の神経回路のみに発現させることを順行性AAVならびに逆行性AAVを用いて達成した。一方で、研究代表者が異動のため、研究を実施するための倫理審査に時間がかかってしまったため、今年度での研究はほとんど進めることができなかったものの、新しい実験環境での測定条件の検討を行った。

運動・感覚疾患、神経・精神疾患は、脳―身体―環境システムの変化に我々が上手く適応できずに障害が生じている状態である。当該疾患を克服するためには、脳に潜在する冗長ネットワークの探索・再動員によるネットワーク構造の再構成、即ち”超適応現象”を適切に誘導する必要がある。一方、もし超適応現象が不適切に生じた場合は例えば幻肢痛のような病態に陥ってしまう可能性がある。しかしながらこれまで超適応現象を適切に誘導する方法は存在しなかった。こうした状況下最近研究代表者らは、心的外傷後ストレス障害（PTSD）モデル動物において、時間特異的報酬系脳領域刺激による恐怖消去学習の適切な強化にプレリミナリに成功した。そこで本研究では、時間特異的報酬系脳領域刺激がPTSDのみならず他の神経・精神疾患の症状も制御可能か検討することで、超適応現象の適切な誘導法を確立することを目的とした。 本年度は、神経・精神疾患モデル動物（うつ病、アルツハイマー型認知症）において、時間特異的脳深部刺激による症状制御実験に成功した。具体的には、まず、うつ病モデルラットにおいて、減弱した嗅球―梨状皮質間におけるガンマ周波帯脳活動を時間特異的脳深部刺激で増強することで、うつ病様行動を寛解できることを見出した。さらに、家族性アルツハイマー病患者由来変異を有するヒト化アミロイド前駆タンパク質のノックインマウスにおいて、時間特異的報酬系脳領域刺激で、一度障害された認知機能を回復させることに成功した。

てんかんは何らかの原因で脳内に発作感受性/けいれん準備性（発作の起こしやすさ）が形成されて、発作を繰り返し生じる病態である。てんかん根治のためには、発作感受性を客観的に評価し、低減・消去する手法を開発する必要がある。しかしこれまで発作感受性の定量法の欠如が根治療法の研究開発を妨げてきた。そこで本研究では、大規模脳活動記録から発作感受性を説明する脳活動パターンを情報学的手法で抽出・同定して発作感受性の程度を定量化する技術を開発すること、および同定した脳活動パターンの解析とその定量法を用いて発作感受性を低減・消去する手法を創出することを目的とした。 令和３年度までに発作感受性脳活動パターンの抽出・モデル化に成功していた。当該成果を受け、令和４年度はさらに以下の項目を達成した。 1. 発作感受性を低減する脳深部刺激法の開発：発作感受性脳活動パターンが乏しい脳状態をトリガーにした報酬系脳領域刺激で発作感受性が低い脳状態を強化することで、発作感受性を低減するてんかん根治療法の開発を目指した。まず前年度までに見出した発作感受性を説明する脳活動パターンを実時間検出するアルゴリズムを確立した。次に報酬系脳領域に刺激電極を刺入し、条件付け場所嗜好性試験により、当該脳部位の電気刺激によるオペラント条件付けの成立を確認した。 2. 新しい経頭蓋脳刺激法の開発：経頭蓋集束超音波刺激法は経頭蓋集束電気刺激法に比べて空間解像度および深部到達性が高い。そこで自由行動ラットの頭蓋骨に慢性留置可能な小型超音波トランスデューサーを作製した。 3. 臨床研究：難治性てんかん患者を対象にした閉ループ経頭蓋集束電気刺激法の臨床研究をハンガリーにおいて実施した。検討を行った5人全ての患者において閉ループ経頭蓋集束電気刺激法による顕著な発作制御効果を認めた。重篤な有害事象は認められなかった。

In this research project, we combine temporally and spatially weak current stimulation from multiple electrodes placed on the head to intervene in the brain network, including non-damaged areas, to achieve the normalization of abnormal brain activity at the chronic phase of stroke. As a proof-of-concept of the working hypothesis, we attempted to reconstruct walking function of the stroke patients, and researched and developed a method that combines anodal stimulation of the supplemental frontal cortex (SMA) and oscillating stimulation of the primary motor cortex (M1) on the affected side.

Drug-resistant epilepsy lacks effective treatments other than highly invasive surgical resections of seizure foci. Therefore, novel therapeutic technologies that address drug-resistant epilepsy have been desired. We had found that deep brain stimulation targeting the basal forebrain can alleviate seizure symptoms as a potential medical technology to overcome drug-resistant epilepsy in preclinical studies. However, the disruption of normal brain functions by continuous stimulation and the high invasiveness of electrode penetration had been major challenges in research and development of the deep brain stimulation toward clinical application. In this study, found that these challenges can be overcome through time-targeted stimulus deliveries during seizures and novel non-invasive brain stimulation technologies.

統合失調症や薬物依存症などの精神疾患は、通常見られない特有の行動により定義・診断される。精神疾患には遺伝的な要因もあるが、何故遺伝子やそれに伴うシナプス伝達など下層の変化が精神疾患特有の行動表現型に至るのかは分かっていない。これは遺伝子やシナプスの階層と行動層との解離が大きく、論理的な仮説を設定しづらいためであると考えられる。この問題を解決するためには、行動層の直下にあるマクロスコピックな神経回路ダイナミクス（脳活動パターン）に注目して、その行動表現型との因果律を解明すると共に、当該脳活動パターンと下層との関係を解析する戦略が有効である可能性がある。そこで本研究では、まず精神疾患の行動表現型を説明する脳活動パターンを情報学的手法で同定・モデル化し、同定した脳活動を操作することで、脳活動パターンと精神疾患の行動表現型との因果関係を明らかにすることを第一の目的とした。さらに遺伝子・シナプス・メゾ回路層における変容が当該モデルに与える影響を定量化することで、精神疾患の行動表現型が発現するメカニズムの構成的理解を目指す。初年度は、まず精神疾患症状様行動のモデルとしてラットに文脈・感覚入力依存的に意思決定を行わせるオペラントタスクを確立し、当該タスクを実行中の脳活動から行動選択特異的なパターンを機械学習を用いて抽出する技術を確立した。その成果を受け、最終はさらに以下の項目を達成した。
1. 遺伝子・シナプス層変容のモデルとして、統合失調症・薬物依存症モデルラットを導入した。 2. 当該疾患モデルにおいて、上記タスク実行中の多脳領域脳活動（電気生理）記録を行った。 3. 取得した脳活動記録から、疾患症状および行動選択特異的なパターンを抽出・モデル化した。 4. 抽出・モデル化した脳活動パターンに化学遺伝学的に介入することで、当該パターンと疾患表現型との因果関係を証明した。

Neural circuits in the somatosensory system are remodeled during development and/ or by peripheral nerve injury . However, the link between local circuit remodeling and somatotopic reorganization remains unclear.In the present study, we discovered that remodeling of lemniscal fibers (excitatory afferent fibers in the somatosensory thalamus) caused by transection of the primary whisker sensory nerve actually mediated somatotopic reorganization with highly correlated anatomical remodeling and functional rewiring. Specifically, lemniscal fibers carrying genetically visualized whisker-specific information significantly retracted from the whisker sensory thalamus after the transection, whereas those not carrying whisker information ectopically invaded the whisker sensory thalamus.

Peripheral sensory nerve injury causes reorganization of neural circuitry in the central nervous system as well as abnormal ectopic sensation occasionally resulting in pain. However, although contamination of afferent sensory information has been suggested, concrete neural bases and molecular mechanisms of the pain still remain unknown. In the present study, we focused on remodeling of afferent fibers in the whisker sensory thalamus after peripheral sensory nerve injury and its relationship with abnormal ectopic sensation and molecular bases. We found that new afferent innervations from non-whisker brain stem nuclei to the whisker sensory thalamus after transection of the whisker sensory nerve disrupted somatotopic organization in the thalamus. The large-scale anatomical reorganization spatially and temporally correlated with abnormal ectopic sensations after the injury. Furthermore, thalamus-specific knockout of a specific glutamate receptor inhibited the afferent fiber remodeling.

Relay neurons in the somatosensory thalamus of mice receive unusual multiple lemniscal fiber innervations after peripheral nerve transection ; however the origin and wiring of the new lemniscal fibers were unknown. In this study, I found electrophysiological and anatomical evidence for ectopic collaterals of lemniscal fibers innervating neighbor relay neurons after the injury. The rewiring found in this study may be a neural basis for changes in receptive fields in the thalamus or phantom sensations after deafferentations.

四肢の切断や末梢感覚神経の損傷によって求心性入力が遮断されると、視床核においてリモデリングが生じることが知られており、そのリモデリングが幻影痛の原因である可能性がある。しかしながら機能的にシナプスレベルでそのリモデリングを解析した報告はない。マウス体性感覚視床の投射細胞は幼若期において多数の求心性人力(内側毛帯シナプス入力)を受けるが、その後回路の洗練に伴い生後第21日までにただ一本の内側毛帯繊維入力に支配されるようになる。生後21日のマウスにおいて、髭の感覚を伝える三叉神経第二枝(眼窩下神経)を切断して求心性入力を遮断し、一週間後に内側毛帯シナプスの性質をスライスパッチクランプ法により解析した。その結果、眼窩下神経を切断した群では投射細胞が再び多数の内側毛帯繊維人力に支配されるようになることが分かった。新しく投射した内側毛帯繊維を介するシナプス後電流(EPSCs)はコントロールEPSCsに比べて、その振幅が小さく、AMPA受容体を介する成分の減衰時間が延長していた。コントロール群と眼窩下神経切断群に関して、単一繊維ごとに微小EPSCsの素量解析を行ったところ、切断群において新しく投射した内側毛帯繊維のシナプス後部においてAMPA受容体の性質変化が示唆された。電流電圧曲線解析および薬理学的な解析からその性質変化はGluR2サブユニットを含むAMPA受容体の機能的な発現が増大しているためであることが明らかになった。以上により、末梢感覚神経の切断からわずか一週間で視床求心性シナプスの配線変化および伝達物質受容体の変化が生じうることが明らかとなった。これらの変化は幻影痛など除求心性入力によって生じる症状の基盤である可能性がある。

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