The majority of DNA-based transposable elements comprise autonomous and nonautonomous copies, or only nonautonomous copies, where the autonomous copy contains an intact gene for a transposase protein and the nonautonomous copy does not. Even if autonomous copies coexist, they are generally less frequent. The Tol2 element of medaka fish is one of the few elements for which a nonautonomous copy has not yet been found. Here, we report the presence of a nonautonomous Tol2 copy that was identified by surveying the medaka genome sequence database. This copy contained three local sequence alterations that affected the deduced amino acid sequence of the transposase: a deletion of 15 nucleotides resulting in a deletion of 5 amino acids, a base substitution causing a single amino acid change, and another base substitution giving rise to a stop codon. Transposition assays using cultured human cells revealed that transposase activity was reduced by the 15-nucleotide deletion and abolished by the nonsense mutation. This is the first example of a nonautonomous Tol2 copy. Thus, Tol2 is in an early stage of decay in the medaka genome, and is therefore a unique element to observe an almost complete decay process that progresses in natural populations.

The photoperiod-insensitivity allele e1 is known to be essential for the extremely low photoperiod sensitivity of rice, and thereby enabled rice cultivation in high latitudes (42-53° north (N)). The E1 locus regulating photoperiod-sensitivity was identified on chromosome 7 using a cross between T65 and its near-isogenic line T65w. Sequence analyses confirmed that the E1 and the Ghd7 are the same locus, and haplotype analysis showed that the e1/ghd7-0a is a pioneer allele that enabled rice production in Hokkaido (42-45° N). Further, we detected two novel alleles, e1-ret/ghd7-0ret and E1-r/Ghd7-r, each harboring mutations in the promoter region. These mutant alleles alter the respective expression profiles, leading to marked alteration of flowering time. Moreover, e1-ret/ghd7-0ret, as well as e1/ghd7-0a, was found to have contributed to the establishment of Hokkaido varieties through the marked reduction effect on photoperiod sensitivity, whereas E1-r/Ghd7-r showed a higher expression than the E1/Ghd7 due to the nucleotide substitutions in the cis elements. The haplotype analysis showed that two photoperiod-insensitivity alleles e1/ghd7-0a and e1-ret/ghd7-0ret, originated independently from two sources. These results indicate that naturally occurring allelic variation at the E1/Ghd7 locus allowed expansion of the rice cultivation area through diversification and fine-tuning of flowering time.

イネ品種銀坊主の種子にガンマ線照射して得られた細粒突然変異系統IM294は,イネユビキチン様タンパク質遺伝子Rurm1(Rice ubiquitin-related modifier-1)の機能を喪失している.RURM1と高い相同性を示す酵母のUrm1pは,酸化ストレス応答タンパク質Ahp1pの機能を修飾することで酸化ストレス応答に関与することから,Rurm1もイネの酸化ストレス応答に関与している可能性があるがその詳細は未解明である.本研究は,イネの酸化ストレス応答におけるRurm1の役割を明らかにするために,酸化ストレス誘導薬剤であるメチルビオロゲン(MV)に対する銀坊主およびIM294の耐性を調査した.MV処理によるクロロフィルa,b含量の減少程度を調べたところ,処理濃度が高くなるにつれて銀坊主およびIM294いずれにおいてもクロロフィル含量は大きく低下した.しかし,クロロフィル含量の減少程度に関しては,銀坊主・IM294間に有意差はなかった.このことから,イネにおいて,Rurm1はMVによって誘導される酸化ストレスに対する防御機構には関与しないことが示唆された.

We describe a transient dual-luciferase assay combined with a glucocorticoid-inducible system for rice protoplasts. Luciferase genes were efficiently induced by adding 0.1 µM of dexamethasone to the protoplast suspension, the activity of the luciferases reaching a maximum 6 h after induction. This assay system is applicable to studying the translation efficiency of rice by using the luciferase gene harboring tandem copies of an interesting codon at the 5' end.

農業上重要な遺伝子を同定するための相補性検定において,形質転換効率の改善は重要である.しかしながら,アグロバクテリウムを介したイネ形質転換効率において大きな品種間差異が存在する.銀坊主には,非常に活性化された転移因子mPingが内在しており,価値の高い研究材料である.我々は,mPing SCARマーカーおよびmPingタギングシステムを利用し,銀坊主に誘発された突然変異遺伝子を同定することに成功してきた.しかしながら,銀坊主の非常に低い形質転換効率は,候補遺伝子の相補性検定および機能解析の妨げとなっている.本報では,銀坊主に適した効果的なアグロバクテリウム形質変換法を報告する.銀坊主は,アグロバクテリウム感染に対する耐性が極めて弱く,アグロバクテリウムとの共存培養後に活性のあるカルスを再生することが困難であった.これを克服するために,感染には非常に低濃度のアグロバクテリウムを,一次スクリーニングでは高濃度のメロペンを使用した.また,共存培養時に感染したカルスを紙タオルで水分を拭き取って乾燥した状態を保つことも重要であった.その結果,一度に十分量の形質転換体を獲得することが可能となった.形質転換効率は14.3%であり,再生効率は90%以上であった.

菌床培地において、正常株nは全ての栽培瓶で子実体を形成した。変異株d3とd4は一部の栽培瓶で菌床表面の一部のみから子実体を形成したことから、両株は子実体形成に関して極めて不安定であるものの、完全な子実体形成不能ではないと判断した。一方、変異株d5は菌床面に子実体原基の様な凹凸は観察されたが、それ以上の分化はみられなかったことから、完全な子実体形成不能株であると判断した。フラスコ内のMYS液体培地において、正常株nでは25℃で培養した栄養菌糸体を15℃の低温下に培養温度を変更することで子実体を形成したが、変異株d3、d4、d5では低温下でも子実体は形成されなかった。 RNA-seq解析において、エノキタケの子実体形成期に特異的に発現することが知られているFDS遺伝子やエノキタケを含む数種の菌類でも子実体形成期に発現するhyd1遺伝子が、低温刺激を与えた正常株でのみ誘導される遺伝子としてピックアップされた。RT-qPCRによる子実体形成関連遺伝子の発現解析において、Fvhyd1遺伝子とFvFDS1遺伝子は低温刺激を与えた、変異株d3、d4では発現せず、正常株nの原基形成期に特異的に発現していた。しかし、低温刺激を与えた、変異株d5では両遺伝子の発現が確認されたことから、この2つの遺伝子は子実体原基形成において、必要条件であるが十分条件では無いと考えられた。また、両遺伝子の発現はすべての菌株で連動していたことから、これらの発現を制御する共通の転写調節因子の存在が考えられる。本研究によって、これまで野生株を用いた子実体形成期に発現すると観察されていたFDS1やhyd1遺伝子の特性が、子実体形成不全株を用いることで、より明確に示された。

イネ熱帯ジャポニカ品種Oiranは、mPingが転移しているイネ品種銀坊主と同じSNPタイプのPingが存在するにもかかわらず、Pingは発現しておらず、mPingも転移していない。今年度はまず、Oiranとイネ温帯ジャポニカ品種日本晴（Pingは発現している）のPingのプロモーター領域のDNAメチル化を調査した。その結果、日本晴と比較して、OiranではPingのプロモーター領域が高度にメチル化されていた。このことから、OiranではPingの発現を全身的に抑制する因子によってmPingの転移が抑制されていると考えられた。そこで、Oiranと日本晴の交雑後代（ON系統）を作出し、Pingの発現とメチル化程度を調査した。その結果、ON系統F1個体では、Pingのプロモーター領域のメチル化が低下しており、Pingの発現量が日本晴と同程度であった。このことから、OiranにおけるPing発現抑制因子は日本晴にも対立遺伝子がある場合は劣性であるか、日本晴には別の座にPing活性化因子が存在する可能性が示唆された。Oiran由来のPingのみをホモで有するON系統F2個体群において、Ping発現抑制因子をもたない個体が現れるのではないかと期待されたが、Pingの発現量が日本晴以上あるいは同程度の個体は得られなかった。Pingが抑制されていたON系統F2個体では、プロモーター領域が高度にメチル化されていた。ON系統F3個体群においては、Pingの発現は抑制されていた。今年度は、OiranにおけるPing発現抑制因子を同定することはできなかったものの、イネの亜種間交雑によってPingのメチル化が低下し、発現が回復することを見出した。また、亜種間交雑によって低下したメチル化は、自殖によって世代を経るごとに再度メチル化することを明らかにした。

単核性発茸特性を示すエノキタケ系統（bmHY4）について、アグロバクテリウムを介した形質転換（AMT）の効率化を進めた。アグロバクテリウム株LBA4404とC58C1ではEHA105と比較して4～5倍の形質転換効率を得た (Tanesaka et al. 2018)。一方、トランスポゾンの自律性転移による変異体の作出を試みた。真菌類Fusarium oxysporum由来の自立性転移因子impalaの全長を含むpUC-imp160領域をバイナリベクター（pPZP-HYG2）のT-DNA領域に導入し（pPZP-imp）、pPZP-impを用いたAMTによるエノキタケ形質転換体を作出した。

本研究は、イネ活性型転移因子mPingが宿主ゲノムのエピゲノムにおよぼす効果を解析するとともに、mPingの転移と宿主のエピジェネティックな制御の関係を解明することで、転移因子を用いたエピゲノム育種を提案しようとするものである。イネ品種銀坊主は1,000コピー以上のmPingを有している。25年度は、Post-bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)法でmPing配列特異的なライブラリーを作成し、次世代シーケンサー(NGS)を用いてコピー間のメチル化状態の網羅的解析を試みた。その結果、mPing内部のシトシンの平均メチル化程度は、CG、CHGおよびCHHサイトにおいてそれぞれ95%、58%および31%であった。本研究結果を基に、これまでの研究で明らかになっている16箇所のmPing挿入位置のメチル化程度を比較解析したところ、活性型mPingではほとんど全てのシトシンのメチル化が低下したのに対して、不活性型mPingではメチル化の低下はほとんどみられなかった。このことから、メチル化程度の減少がmPingを活性化する要因であることが確かめられた。しかし、本年度は、ライブラリーの調整が不十分であったため、コピー間のメチル化程度を比較することはできなかった。ユビキチン様タンパク質をコードするRurm1を機能喪失した突然変異系統IM294においてmPingは、メチル化の変化を伴わず、活発に転移している。これまでの研究から、IM294においては、コドン特異的にタンパク質翻訳が低下することが明らかになっている。IM294におけるmPing活性化機構を明らかにするために、iTRAQを用いた定量プロテオーム解析によって、IM294特異的にタンパク質量が低下している遺伝子の同定を試みた。結果の詳細は、解析中である。

本研究では、イネStowawayファミリー転移因子・Pyongの再活性化を試みた。日本晴を含む温帯ジャポニカ品種には、Pyongは存在せず、染色体5および10を除く全ての染色体にPyongと高い相同性を示す23のPyong様因子が座乗することが明らかになった。しかし、これらは、DNA脱メチル化処理やガンマ線照射では再活性化しなかった。バイオインフォマティクス解析によって、トウモロコシから推定自律性因子Zm-aPyong (Zea mays active Pyong, 3084bp)を同定した。これらの成果によって、StowawayファミリーMITEの転移を解析することが可能になった。

イネトランスポゾンmPingは、プロモーター領域に転移することで下流の遺伝子の発現に低温や塩ストレス応答性を付与することから、新たな発現プロファイルをもつ遺伝子の創出に繋がると期待される。本研究では、まず、mPingが活発に転移しているイネ品種銀坊主を用い、mPing挿入によって生じる変異遺伝子の選抜系を構築した。次いで、プロモーター領域にmPing挿入を有するストレス応答性遺伝子の発現プロフィルとDNAメチル化程度を解析した。その結果、mPingは、既存のプロモーター領域のメチル化程度を変えることなく、近傍のストレス応答性遺伝子のストレス応答性を多様に改変することが明らかになった。

トランスポゾン mPing が活発に転移しているイネ細粒突然変異系統IM294 の自殖後代に出現した強勢変異体 VGI の強勢発現機構を解析した。その結果、強勢発現には mPing の爆発的転移が不可欠であり、VGI1 においては mPing 挿入を内部もしくは近傍に有する遺伝子が 20 個存在することが明らかになった。本研究の結果は、トランスポゾンが転移によって生物進化を牽引することを実験的に示唆したものである。

イネ MITE・mPing は、品種銀坊主において今なお活発に転移している。本研究において、(1)mPing は近傍遺伝子の発現に正もしくは中立な効果を付与すること、(2)銀坊主には mPing 転移を制御する遺伝的要因が存在すること、および(3)ユビキチン様タンパク質 RURM1 の機能喪失が mPing 転移に起因する遺伝的多様性の拡大に有効であることが明らかになった。これらの成果によって、mPing を用いた高効率トランスポゾンタギング法の基盤が確立できた

mPingの起源を明らかにするためにOryza属19種50系統におけるmPingの分布を調査した。その結果、mPing配列は供試した全てのOryza種に分布し、遠縁種間でもmPingの配列は極めて高度(99%以上)に保存されていた。野生イネに見いだされたmPing配列は3種に大別でき、銀坊主で最初に見出された430bpのもの(I型)、242-252にかけて9塩基の置換を有するもの(II型)、および239-249にかけての11塩基が欠失しているもの(III型)があった。後2者の分布がAAゲノムのO.sativa、O.rufipogonに限定されているのに対して、I型は一部のAAゲノム種を除く全ての種に見出された。したがって、mPing配列の起源はOryza属の種分化以前に遡ると考えられた。また、PongはO.sativaおよびO.rufipogonの全ての系統に認められたにも関わらず、Pingの分布は一部の系統に限られていた。このことは、Pongの起源はO.rufipogonが他のAAゲノム種から分化するときに遡り、PingはPongの後から起源したことを示唆している。銀坊主はmPingならびにPingの数が極めて多い特異な遺伝子型をもつ。とりわけmPingは、既に1000コピー以上に達しているにもかかわらず、毎世代増幅を続けている。銀坊主においてmPingの転移が抑制されない原因を解明するため、mPing転移が抑制されている日本晴と銀坊主との交雑後代F_4個体別F_5系統を用いて系統毎に親個体にはない新規挿入数を調査した。さらに、銀坊主と日本晴との間のmPing挿入多型を利用して作製した遺伝子地図に基づいたmPing活性に関するQTL解析を実施した結果、銀坊主のmPing転移活性に関与するQTLを染色体1および4に検出した。

MITEsは、転移に伴って遺伝子の構造やその発現を変えることから、生物の進化に大きく関わっていると考えられる。非自律性トランスポゾンmPingは、動植物を通じて初めて同定された転移活性を有するイネのMITEである。これまでの研究から、mPingは、イネ品種銀坊主において通常の栽培条件下でも高い転移活性を有しており、遺伝子近傍に転移しやすいことが明らかとなっている。mPingの転移には、自律性因子PingおよびPongがコードする転移酵素が不可欠であり、それらのコピー数は品種間で異なる。本研究では、まず、銀坊主におけるPingの座乗位置の調査の過程において、Tc1/marinerスパーファミリーに属する新規トランスポゾンPyongを同定した。データベース検索の結果、品種日本晴の染色体1および12にもPyongと90%以上の高い相同性を示す配列がに存在することが明らかとなった。このことは、Pyong因子は、近年、イネゲノム中で増加したことを示唆している。次いで、銀坊主、日本晴および細粒突然変異系統IM294のcDNAを用いたトランスポゾンディスプレイ法によって、mPing配列を含んで転写される遺伝子の同定を試みた。その結果、mPing配列を含んで転写されている11の領域が同定された。これらのうち、6つは遺伝子の転写領域、5つは遺伝子をコードしない領域であり、供試品種・系統間にはこれら領域にmPing挿入多型があることが明らかとなった。また、mPing挿入がある遺伝子のmPing挿入位置より上流および下流の転写量を調査したところ、mPing挿入位置より下流の転写量が顕著に低下していることが明らかとなった。これらのことは、mPingの挿入が、ゲノムの構造のみならず、近傍配列の転写を増進および抑制していることを示唆している。