Autophagy suppresses tumourigenesis in normal cells, but in established tumours, it can promote tumour progression, particularly by enhancing resistance to stress. However, the mechanism underlying this tumour-promoting function remains unclear. To investigate this, we adopted an interdisciplinary approach combining database analysis with experimental validation. Specifically, by classifying the autophagy-related genes using AutoML analysis on their expression patterns in the COSMIC database, we identified an autophagy subnetwork that correlated with the PLK1-RAD9A axis, a pathway we had previously linked to genotoxic resistance. Cell-based experiments confirmed that autophagy enhanced polo-like-kinase1 (PLK1) expression at both the transcriptional and translational levels, facilitating genotoxic resistance. Notably, in stressed S-phase cells, we found that PLK1 expression levels varied among individual cells, yet overall cell population acquired genotoxin resistance. The genotoxin resistance in the cell population with heterogeneous PLK1 expression was driven by autophagy by facilitating the secretion of currently unidentified factors, likely by switching function of RAD9A from DNA checkpoint to substance secretion. Together our data demonstrate that intra-tumour heterogeneity contributes to the malignant features of tumours through an autophagy-PLK-RAD9A axis that promotes intercellular communication via secretion.

β2-Microglobulin (β2m) is the causative protein of dialysis-related amyloidosis, and its D76N variant is less stable and more prone to aggregation. Since their crystal structures are indistinguishable from each other, enhanced amyloidogenicity induced by the mutation may be attributed to changes in the structural dynamics of the molecule. We examined pressure and mutation effects on the β2m molecule by NMR and MD simulations, and found that the mutation induced the loosening of the inter-sheet packing of β2m, which is relevant to destabilization and subsequent amyloidogenicity. On the other hand, this loosening was coupled with perturbed dynamics at some peripheral regions. The key result for this conclusion was that both the mutation and pressure induced similar reductions in the mobility of these residues, suggesting that there is a common mechanism underlying the suppression of inherent fluctuations in the β2m molecule. Analyses of data obtained under high pressure conditions suggested that the network of dynamically correlated residues included not only the mutation site, but also distal residues, such as those of the C- and D-strands. Reductions in these local dynamics correlated with the loosening of inter-sheet packing.

[要旨]損傷菌の菌数測定には培養法が用いられることが多いが、細胞計測法のFlow cytometry (FCM) では、生菌、死菌、および損傷菌の迅速評価が可能である。本研究では、Listeria monocytogenesの代替株であるL.innocua (毒素陰性株)の薬剤損傷菌数測定について、培養法のThin agar layer (TAL)法とFCM法の比較 を行った。有効塩素謹度0～6ppmの強酸性電解水で処理したとき、TAL法では1ppmおよび2ppmの強酸性電解水処理において、選択培地よりもTAL培地で0.6log菌数が多く検出され、それぞれ59%および67%の損傷薗が生残したことが示唆された。 一方FCM法では、生菌を染色する膜透過型DNA染色剤 (thiazole orange:TO) と、死菌を染色する膜非透過型DNA染色剤 (propidium iodide:PI) での二重染色の結果、TOとPIの両方に染色された損傷菌の割合は、有効塩素濃度 1～3ppmでそれぞれ59%～78%となった。薬剤損傷L. innocuaの回復においては、TAL法では2時間後には損傷菌が未検出となったが、FCM法では4時間後まで損傷菌が生残していた。この結果より回復期の薬剤損傷菌の検出においては、二つの方法で違いがあることが示された。[Abstract]Culture-based methods are often used for the enumeration of sublethally injured bacteria,while flow cytometry(FCM)can provide rapid quantitation of live,dead,and injured bacteria. In this study,the culutur-based thin agar layer(TAL)method was compared with a FCM assay to enumerate chlorine-injured Listeria.innocua,a surrogate for L.monocytogenes.Bacteria were injured by mixing them with diluted electrolyed water containing 0 to 6 ppm available chlorine. In the TAL method,counts of L.innocua exposed to 1 to 2 ppm available chlorine were 0.6log higher on the TAL medium than on the selective medium than on the selective medium,indicating that 59 to 67% of the viable cells were injured by a chlorine level of 1 to 2 ppm.In comparison,the available chlorine level of 1 to 3 ppm caused sublethal injury ranging from 59 to 78% as determined by the FCM assay based on the quantitation of staned cells with both permeant DNA dye (thiazole orange:TO)and impermeant DNA dye (propidium iodide:PI),relative to live and dead cells that were stained only with TO and PI,respectively.With regard to recovery of chlorine-injured L.innocua after treatment with electrolyzed water,injured cells were inactivated after two hours when enumerated with the TAL method,whereas injured cells remained injured for four hours after the treatment as determined by the FCM assay.This result indicated a difference in the detection of chlorine-injured L.innocua between the two methods during the recovery period of injuredv cells.

BACKGROUND: Intracellular heme plays versatile roles in a variety of physiological processes including mitochondrial respiration. Heme also induces the expression of genes such as heme oxygenase-1 (HO-1) by inactivating the transcription repressor Bach1 through direct binding. However, the source of heme for the regulation of the Bach1-HO-1 axis has been unclear. Considering that extracellular heme exists as a complex with hemopexin (Hx) in serum under the physiological conditions, heme-Hx complex may deliver heme for the gene regulation. METHODS: Using a mammalian expression system, high secretory recombinant Hx (rHx) was developed. We examined the effects of rHx-bound heme on HO-1 expression and Bach1 in Hepa-1c1c7 liver cells and THP-1 macrophage cells. We investigated the uptake pathway of rHx-bound heme by treating cells with chlorpromazine (CPZ). RESULTS: rHx-bound heme induced the expression of HO-1 and decreased the level of Bach1 protein. CPZ inhibited the induction of the HO-1 expression by rHx-bound heme. CONCLUSION: rHx-bound heme was internalized into the cells via endocytosis, resulting in HO-1 expression and inactivation of Bach1. GENERAL SIGNIFICANCE: The Bach1-dependent repression of the HO-1 expression is under the control of the Hx-dependent uptake of extracellular heme. Heme may regulate Bach1 as an extracellular signaling molecule.

畜産物の国際競争力アップのために、肉質の向上が必要である。現在、肉質はと畜後の肉ブロックで解析しているため、本来販売するべき肉ブロックを試験用に確保する必要がある。本研究では、肉質判定のための血清メタボローム解析技術の確立とその簡易化を目指す。飼養管理に加え、肥育中の代謝変動を網羅的に解析する生体血清メタボローム解析を行うことで、畜産ビッグデータを構築する。令和３年度は、和歌山県内の一般農家および畜産試験場でエコフィードとして山椒種子を給餌した試験区、脱塩梅酢エキスを給餌し肥育した豚について、血清NMRメタボローム解析を行った。代謝物は豚でもヒトでも同じであるため、参考にするNMRスペクトルはヒューマンメタボロームデータベース(HMDB)を利用した。しかし、NMRピークの約6割しか代謝物の推定に成功しないという問題点が生じた。 そこで、各代謝物由来のNMRピークは必ずその量に連動して増減することを利用し、複数のNMRメタボロームデータを用い、連動するピークを検出する方法を確立した。これにより、NMRピークについて代謝物濃度の変換せずに全ピークを使って肉質パラメータとの相関、連動を解析することができるようになった。計算能力の高いワークステーションを解析用サーバーとして利用し、Rおよびpythonをブラウザ経由で使うように設定できたため、各種機械学習が試せる環境が整った。令和３年度はautogluonを用いた解析方法を確立し、NMRピークと肉質パラメータの相関を見ることができた。

疾患モデル動物のメタボローム解析により、疾患において変動する核内受容体リガンドを探索した。その結果、ポルフィリアモデルにおいてヘム合成の中間代謝物が核内受容体PPARgリガンドとして作用することを見つけた。最終産物のヘムは作用しないことから、鉄の量が律速となっており、中間代謝物が蓄積することでPPARgの活性が変動している可能性が示唆された。実際に、優性で遺伝する家族性のポルフィリア患者で見つかったALAS遺伝子の変異を導入したALAS遺伝子を細胞に発現するとヘムではなく中間代謝物が蓄積することを確認した。蓄積した中間代謝物は細胞外へと分泌された後、アルブミンと結合することでマクロファージへと貪食されることを見いだした。従って、ポルフィリアモデル細胞と共培養したマクロファージに発現するPPARg蛋白質はこの中間代謝物によって抑制性の活性制御を受けることがわかった。この中間代謝物に類似する様々な化合物のPPARgへの作用の有無を検討した結果、この中間代謝物のビニル基がPPARgへの作用に必須である事が明らかとなった。PPARgへの作用機構を解析し、この中間代謝物のビニル基がPPARgのシステインに共有結合していることを見いだした。生活習慣病の中でも特に動脈硬化のリスクファクターとして、ポルフィリアは古くより知られている。今回、ポルフィリアにおいて蓄積するヘム合成中間代謝物がPPARgに共有結合することで活性を抑制することが、生活習慣病の発症もしくは増悪を引き起こしている可能性が示唆された。

According to our previous findings of endogenous ligands for PPARg, we hypothesized that extracellular signaling molecules regulate PPARg activity through not only their intracellular metabolites acting as ligands, but also intracellular signals evoked by membrane associated receptors.To analyze the temporal and spatial regulation of PPARg activity, we developed novel reporter system, by which six independent transcriptional activities were simultaneously detected. We found that expression of phosphorylation induced stabilization of PPARg proteins by itself and blocked nuclear export of PPARg protein only in the presence of SDP-1. We also analyzed the effects of PPARg mutation identified in German obese subjects on the phoshphorylation-dependent regulation, and found that P85Q mutation blocked the effects of SDP-1. Thus, we conclude that phosphorylation signal regulates PPARg activity in the distinct mechanism from that of ligands.

Various "-ome" researches are currently ongoing. Although we acknowledge that these data are enormous collections for elementary pieces of biological phenomena, it remains unclear how biological system connects these pieces each other at the molecular level. In our research project, we focused on the apparently classical theme, "functional coupling between transcription and cellular metabolism". From this point of view, we have focused on nuclear receptors, and revealed the structural basis for how transcription factors monitors cellular metabolites and regulates homeostasis.

本研究では、核内受容体PPARγが内在性のリガンドと共有結合することにより活性化する過程について、リガンド側のスペクトルの変化と受容体側の構造変化のキネティクスを解明することを目標とした。申請書においては同時測定を目指すことも構想していたが、本研究ではリガンドと受容体の変化を別々に測定した。キネティクス測定に加えて、活性化過程の各状態の立体構造を解析することに成功した。リガンド側のスペクトル変化のキネティクス解析から、リガンドは一旦受容体と非共有結合中間体を形成した後に共有結合状態に至ることが明らかとなった。非共有結合中間体はダイナミックな状態であるため、通常のリガンドを用いた場合安定にとらえることはできない。そこで、非共有結合中間体でとどまる新規リガンドを検索し、蛍光標識脂肪酸がこの状態でとどまることを明らかにした。蛍光タンパク質と融合した核内受容体とこの蛍光標識脂肪酸との間の結合依存的起る蛍光共鳴エネルギー移動を利用し、非共有結合中間体に至る結合キネティクスを測定することに成功した。受容体がリガンドのない状態から非共有結合中間体、共有結合複合体へと至る過程でどのような構造変化をするかを知るために、この3状態の結晶構造を解析した。その結果、非共有結合中間体では受容体のヘリックス2と3の間にあるオメガループが構造変化し、その後共有結合に伴ってヘリックス3にあるフェニルアラニンの側鎖がフリップすることがわかった。オメガループにトリプトファンを導入しリガンド結合に伴う構造変化をスペクトル解析により確認した。またフェニルアラニンが内在性リガンドによる活性化に必須であることを確認した。

1, Expression of microsomal prostaglandin E' synthase (mPGES) in the brain and its physiological significance. ・We cloned rat mPGES cDNA. ・mPGES mRNA and its protein were induced in brain endothelial cells in response to lipopolysaccharide (LPS) ・Induced mPGES and cyclooxygenase 2 (COX 2) were colocalized in the perinuclear region of brain endothelial cells. ・A COX-2-specific inhibitor suppressed elevation of PGE2 level in the cerebrospinal, fluid (CSF). ・Time courses of COX 2 and mPGES expression in brain endothelial cells were well correlated with that of fever and PGE2 level in the CSF. ・mPGES gene deficient mice did not develop fever in response to LPS, and other pyrogenic stimuli. ・Isolated subarachnoidal brain blood vessels with meninges from LPS pretreated rats produced more PGE2 than those from saline-pretreated rats. The relative increase in PGE2 production by LPS pretreatment was most prominent among other prostanoids tested. ・These results indicate that 'mPGES induced in brain endothelial'cells is involved in fever. 2, Efferent neural pathway from PGE2 receptor to a thermogenic organ, brown adipose tissue (BAT). ・Injection of PGE2 into the cerebral ventricle or preoptic area induced elevation of BAT temperature and FOS expression in the medullary raphe nucleus (raphe pallidus; RPa). ・Elevation of BAT temperature by PGE2 was completely suppressed by an injection of muscimol, a GABA agonist, into the RPa. ・Retrograde and anterograde neural tracing revealed a direct projection of EP3 (a PGE2 receptor subtype)-bearing cells in the preoptic area to the RPa. ・A part of EP3bearing cells in the preoptic area were GABAergic. ・In the Rpa, neurons expressing vesicular glutamate transporter 3 (VGLUT3) projected to the sympathetic preganglionic neurons in the intermediolateral nucleus of the spinal cord. ・Collectively, these results revealed a neural. efferent pathway for fever originating from the EP3 bearing cells in the preoptic area to the BAT through RPa and sympathetic nervous system.

When temperature (T) of skin decreases stepwise, cold fibers evoke transient efferent discharges, inducing cold sensation and heat-gain responses. Hence we have proposed that cold receptors at distal ends of cold fibers are thermostats to regulate skin T against cold. Here, with patch-clamp techniques, we studied the ionic basis of cold receptors in cultured dorsal root ganglion (DRG) neurons of rats, as a model of nerve endings. Cells that increased cytosolic Ca(2+) level in response to moderate cooling were identified as neurons with cold receptors. In whole-cell current-clamp recordings of these cells, in response to cooling, cold receptors evoked a dynamic receptor potential (RP), eliciting impulses briefly. In voltage-clamp recordings (-60 mV), step cooling induced an inward cold current (I(cold)) with mactivation, underlying the dynamic RP. Ca(2+) ions that entered into cells from extracellular side induced the inactivation. Analysis of the reversal potential implied that I(cold) was nonselective cation current with high Ca(2+) permeability. Threshold temperatures of cooling-induced Ca(2+) response and I(cold) were different primarily among cells. In outside-out patches, when T decreased, single nonselective cation channels became active at a critical T. This implies that a cold receptor is an ion channel and acts as the smallest thermostat. Because these thermal properties were consistent with that in cold fibers, we conclude that the same cold receptors exist at nerve endings and generate afferent impulses for cold sensation and heat-gain behaviors in response to cold.

皮膚に分布する冷線維は、冷却あるいはメントールに反応してインパルスを発するバイモダル受容能を持つ。実際、メントールを皮膚に塗ると,皮膚温を一定に保っていても冷感が生じる。すると,次の疑問が生じる。なぜメントールは冷感を生むのか?これに答えるには,バイモダル受容の機構と、脳の特徴の双方を明らかにする必要がある。この研究では,バイモダル受容の機構を解析したバイモダル受容のうち,冷受容のイオン機構はほぼ分かった。ここでは,メントール受容のイオン機構を解析した。 感覚神経の細胞体があるラット後根神経節(DRG)を摘出し,初代分散培養したニューロンを作った。ニューロンにCa蛍光指示薬fura-2を負荷し,冷却で細胞内Caイオン濃度が上昇する細胞を冷受容器細胞と同定した。この細胞からパッチクランプ記録し,イオン機構を探った。ホールセル電流固定法では,メントールは静止電位からの脱分極を誘発し,インパルスを発生した。この脱分極は,メントール受容体が誘発した受容器電位と考えられる。次に,受容器電位のイオン機構を解析した。ホールセル電位固定下(-60mV)では,メントールは内向き電流を誘発した。電流が誘発されたときに、,電位変化を加えて電流-電圧曲線を描いた。電流はほぼ0mVで逆転し,電位に対して外向き整流性を示した。逆転電位が0mVだったので,メントールが活性化したのは非選択的カチオンコンダクタンスと示唆された。冷細胞の細胞膜から切離したパッチクランプ法で,単一チャンネル電流を記録した。メントールは,カチオンチャンネルを活性化した。このチャンネルは,冷チャンネルの性質とよく類似していた。このころから,冷細胞は,冷却にもメントールにも反応してイオンチャンネルを活性化し,インパルスを発生させることがわかった。

光受容細胞、匂い受容細胞では、受容体型グアニレートシクラーゼ-cGMP系がシグナル伝達系として働いている。末梢感覚神経の細胞体が存在する後根神経節にはBタイプ受容体型グアニレートシクラーゼ(GC-B)、環状ヌクレオチド依存性カチオンチャンネル(CNG3)が発現していることから、末梢感覚神経においても同様のシグナル伝達系が存在することがわかった。本研究では温度刺激がこのシグナル伝達系を駆動するかを培養細胞における再構成系により検討した。GC-Bを発現したCHO-K1細胞を生きたまま加温すると、GC-BのリガンドであるCNP依存性のcGMP合成能が低下したが、GC-Bのタンパク質としての酵素活性は加温により上昇した。これは細胞におけるGC-B活性にGC-B以外の因子が関与し、温度依存性の調節を行なっている事を示唆する。GC-Bの活性は熱ショックタンパク質90(HSP90)の阻害剤ゲルダナマイシンで抑制された。つまり、HSP90がGC-B活性を調節している細胞内因子である可能性が示唆された。HSP90の免疫組織化学によりHSP90が後根神経節の神経細胞に発現していることを確認し、免疫沈降法によりHSP90とGC-Bが複合体として存在する事を示した。HSP90とGC-Bの結合は加温やゲルダナマイシンにより解離することがわかった。また、酵母two-hybrid systemによりHSP90のN末端側にあるATP結合領域とGC-Bのカイネース相同領域が直接相互作用する事をみとめた。これらの事から、GC-BはHSP90により調節を受けており、温度変化に対する細胞内cGMPシグナル伝達系を介在すると考えられる。

生理学では、感覚器は環境を監視するセンサーと把握してきた。例えば、冷受容器は、温度を発火頻度(暗号)に変換し脳に送ると説明する。もしセンサーなら刺激と応答に1対1の関係が不可欠だ。だが冷却が冷線維に誘発するインパルス頻度は、閾応答などを示し1対1の関係はない。そこで冷受容器をセンサーだとは考えにくい。これに対し、冷受容器は温度比較器だと、小林は提案している。しかし比較器の実体は明らかでない。本研究では、培養した後根神経節(DRG)細胞にある冷細胞のイオン機構・分子機構を解析し、比較器の実体を解明する。 12年度:Ca濃度の指示薬Fura-2をDRG細胞に負荷し、細胞内Ca濃度[Ca^<2+>]_iを測定する系を立ちあげた。すると冷却で[Ca^<2+>]_iが上昇する少数の細胞が認められた。その細胞からホールセル電流固定記録すると、冷却で脱分極(受容器電位)とインパルスが発生した。ホールセル電位固定下(-60mV)、冷却は内向き電流を誘発した。細胞体から切離した膜片(out-side out patch法)から、冷却で開口する単一チャンネルが記録された。この冷チャンネルを温度比較器の実体と同定した(投稿中)。

暑熱・寒冷に対する温度調節系は個体を用いて分析してきた。しかし,温度調節系が動作するのに個体が必要か,それとも単離した細胞でも可能かは不明である。本研究では,単離した細胞が温度調節系を形成する能力があるかどうかを探る。もしあれば、環境に対する生体の適応現象を試験管の中で調べることが可能となり、物質レベルの解析も可能となろう。皮膚に分布する温線維や冷線維の細胞体が存在する後根神経節(DRG)を単離し培養すると、その細胞中に温、冷に反応する温度受容細胞があることが最近分かった。この研究では、ラット後根神経節の温・冷受容細胞と脊髄から分離した細胞を多電極培養皿(MED,Multi-Electrode Dish)上に撒き、共培養する。細胞の自発発火を多電極で誘導、増幅し、その出力で人工の温熱効果器(ペルチエ素子)を駆動する生体-人工の混合系(ハイブリッドシステム)を作る。培養中の細胞に加温、冷却刺激を繰り返して加える。もし,温度ストレスが加わった時の培養器の温度変化が温度の刺激の繰り返しで縮小するなら,温度調節を行う神経回路が形成したことを意味する。 本年度は、MED上に細胞を培養し、その電極から神経活動を増幅記録する装置一式を導入した。MED上にある電極の持つ電気的性質、電極が出す雑音、周波数特性を計測し、装置にある増幅器の周波数特性、また神経インパルスの発火頻度計測器、電気刺激の方法等を調べ調整を行った。さらに、培養細胞に加える温度刺激装置、培養皿を加温冷却するペルチエの動作を確認した。DRGを摘出し、酵素処理した後に細胞をMED上に撒いた。その結果、MED状に細胞を培養することが可能となった。しかし、電気活動は、現在の段階では記録されていない。

皮膚を冷却すると、冷受容器は冷線維に向心性のインパルスを発し、それが脳に届くと冷感が生じると考えられる。生理学では、冷受容器は温度を発火頻度(暗号)に変換するセンサー、脳は暗号を解読して皮膚温を検出すると捉えてきた。しかし、発火頻度は、温度変化に対し、閾応答、過渡応答を示すので、温度と頻度に1対1の関係はない。そこで、温度受容器をセンサーだとは考えにくい。これに対し、冷受容器それ自身が、皮膚温が閾より高いかどうかを比較し、高い時にインパルス(駆動信号)発するサーモスタットだと代表者は提案している。そのインパルスが,産熱効果器を駆動すれば,他の中枢なしに,温度調節が可能となる。 温度受容器をサーモスタットとするこの新しい概念の妥当性を検討するため,哺乳類,無脊椎動物,単細胞生物の研究者が集まり、生物種ごとのサーモスタットについての研究会を開催した(京都大学、2000年7月7日)。そこでは、サーモスタットの重要性,特徴,実体,遺伝子,さらにサーモスタットが駆動する自律性・行動性効果器などの問題点を議論した。

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