A definitive understanding of intrinsic functions of endogenous melatonin may require genetic manipulation or modification of its synthesizing enzymes. Here, we established Syrian hamsters, a seasonal mammal, carrying loss of function of aralkylamine N-acetyltransferase (AANAT), a rate-limiting enzyme in melatonin biosynthesis. Mutants showed a normal circadian period but an accelerated entrainment to rescheduled light-dark cycles. We next focused on the role of melatonin in autumn/winter anticipation, given the strict increase in levels during short days. On exposure to cold after habituation to short days, all controls maintained normal core body temperature (T b), whereas many mutants showed a decrease in T b. Food shortage after this cold exposure induced hibernation in all controls and mutants; however, all mutants failed to continue a normal hibernation cycle, probably due to impaired T b elevation during arousal from deep hibernation. These failures were accompanied by a decreased volume of lipid droplets in the interscapular brown adipose tissue (iBAT). Histological analyses of the pars tuberalis suggested a defect in photoperiodic responsiveness in mutants. Taken together, these findings demonstrate that defective photoperiodic responsiveness caused delayed remodeling of the iBAT in mutants and that sudden exposure to autumn/winter conditions caused severe defects in T b homeostasis and interbout arousal, in both of which iBAT-mediated nonshivering thermogenesis plays a major role. AANAT-mediated melatonin biosynthesis appears to be indispensable to the survival of wild seasonal mammals in natural settings.

Collagen I is the most abundant type of intramuscular collagen. Lysyl oxidase promotes collagen cross-link formation, which helps stabilize the extracellular matrix. Furthermore, matrix metalloproteinases, responsible for collagen degradation, maintain typical muscle structure and function through remodeling. Although it is well known that aging leads to delayed recovery of muscle fibers, the impact of aging on the remodeling of intramuscular collagen is not well understood. In this study, we investigated the impact of aging on collagen remodeling during muscle injury recovery using young and old mouse models. Muscle injury was induced in the right tibialis anterior (TA) muscle of male C57BL/6J mice [aged 21 weeks (young) and 92 weeks (old)] using intramuscular cardiotoxin injection, with the left TA serving as a sham with saline injection. Following a one-week recovery period, aging was found to delay the recovery of the fiber cross-sectional area. The intensity and area of immunoreactivity for collagen I were significantly increased in old mice compared to young mice post-injury. Additionally, Lox expression and the number of LOX (+) cells in the extracellular matrix significantly increased in old mice compared to young mice post-injury. Furthermore, Mmp9 and MMP9 expression levels after muscle injury were higher in old mice than in young mice. These results suggest that muscle injury in old mice can lead to increased collagen I accumulation, enhanced collagen cross-link formation, and elevated MMP9 expression compared to young mice.

Obesity and aging are known to affect the skeletal muscles. Obesity in old age may result in a poor basement membrane (BM) construction response, which serves to protect the skeletal muscle, thus making the skeletal muscle more vulnerable. In this study, older and young male C57BL/6J mice were divided into two groups, each fed a high-fat or regular diet for eight weeks. A high-fat diet decreased the relative gastrocnemius muscle weight in both age groups, and obesity and aging individually result in a decline in muscle function. Immunoreactivity of collagen IV, the main component of BM, BM width, and BM-synthetic factor expression in young mice on a high-fat diet were higher than that in young mice on a regular diet, whereas such changes were minimal in obese older mice. Furthermore, the number of central nuclei fibers in obese older mice was higher than in old mice fed a regular diet and young mice fed a high-fat diet. These results suggest that obesity at a young age promotes skeletal muscle BM formation in response to weight gain. In contrast, this response is less pronounced in old age, suggesting that obesity in old age may lead to muscle fragility.

The localization and function of synaptotagmin (syt)17 in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the brain, which is the master circadian oscillator, were investigated. The Syt17 mRNA-containing neurons were mainly situated in the shell region while SYT17 immunoreactive cell bodies and neural fibers were detected in the core and shell of the SCN and the subparaventricular zone (SPZ). Further, electron microscopy analysis revealed SYT17 in the rough endoplasmic reticulum (rER), Golgi apparatus (G), and large and small vesicles of neurons. Syt17 mRNA expression in the SCN showed a circadian rhythm, and light exposure at night suppressed its expression. In addition, the free running period of locomotor activity rhythm was shortened in Syt17-deletion mutant mice. These findings suggest that SYT17 is involved in the regulation of circadian rhythms.

In mammals, the center of the circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. Many studies have suggested that there are multiple regions generating different circadian periods within the SCN, but the exact localization of the regions has not been elucidated. In this study, using a transgenic rat carrying a destabilized luciferase reporter gene driven by a regulatory element of Per2 gene (Per2::dLuc), we investigated the regional variation of period lengths in horizontal slices of the SCN. We revealed a distinct caudal medial region (short period region, SPR) and a rostro-lateral region (long period region, LPR) that generate circadian rhythms with periods shorter than and longer than 24 hours, respectively. We also found that the core region of the SCN marked by dense VIP (vasoactive intestinal peptide) mRNA-expressing neurons covered a part of LPR, and that the shell region of the SCN contains both SPR and the rest of the LPR. Furthermore, we observed how synchronization is achieved between regions generating distinct circadian periods in the SCN. We found that the longer circadian rhythm of the rostral region appears to entrain the circadian rhythm in the caudal region. Our findings clarify the localization of regionality of circadian periods and the mechanism by which the integrated circadian rhythm is formed in the SCN.

We investigated the effect of aging on the basement membrane during post-injury muscle recovery. Using a rat model, we found that aging delayed muscle fiber and basement membrane recovery. In addition, expression of basement membrane-related factors peaked 7 days after muscle injury among both young and older rats. Peak expression of collagen IV synthetic factors decreased with age, whereas expression of the degradative factor was unaffected by age. These results suggest that age-related delays in post-injury muscle fiber and basement membrane recovery may be related to suppression of collagen IV synthetic factors.

The basement membrane (BM)-related factors, including collagen IV, are important for the maintenance and recovery of skeletal muscles. Aging impairs the expression of BM-related factors during recovery after disuse atrophy. Muscle activity facilitates collagen synthesis that constitutes the BM. However, the effect of endurance exercise on the BM of aged muscles is unclear. Thus, to understand the effect of endurance exercise on the BM of the skeletal muscle in aged rats, we prescribed treadmill running in aged rats and compared the differences in the expression of BM-related factors between the aged rats with and without exercise habits. Aged rats were subjected to endurance exercise via treadmill running. Exercise increased the mRNA expression levels of the BM-related factors, the area and intensity of collagen IV-immunoreactivity and the width of lamina densa in the soleus muscle of aged rats. These finding suggests that endurance exercise promotes BM construction in aged rats.

Heavy water lengthens the periods of circadian rhythms in various plant and animal species. Many studies have reported that drinking heavy water lengthens the periods of circadian activity rhythms of rodents by slowing the clock mechanism in the suprachiasmatic nucleus (SCN), the mammalian circadian center. The SCN clock is stable and robust against disturbance, due to its intercellular network. It is unclear whether this robustness provides resistance to the effects of heavy water. Here, we report that heavy water lengthened the rhythm period of clock gene expression of the SCN and peripheral tissues in vitro using a PERIOD2::LUCIFERASE bioluminescence reporter. Our results show that the period-elongation rate of the SCN is similar to those of other tissues. Therefore, the intercellular network of the SCN is not resistant to the period-elongation effect of heavy water.

The circadian rhythms are endogenous rhythms of about 24 h, and are driven by the circadian clock. The clock centre locates in the suprachiasmatic nucleus. Light signals from the retina shift the circadian rhythm in the suprachiasmatic nucleus, but there is a robust part of the suprachiasmatic nucleus that causes jet lag after an abrupt shift of the environmental lighting condition. To examine the effect of attenuated circadian rhythm on the duration of jet lag, we established a transgenic rat expressing BMAL1 dominant negative form under control by mouse Prnp-based transcriptional regulation cassette [BMAL1 DN (+)]. The transgenic rats became active earlier than controls, just after light offset. Compared to control rats, BMAL1 DN (+) rats showed smaller circadian rhythm amplitudes in both behavioural and Per2 promoter driven luciferase activity rhythms. A light pulse during the night resulted in a larger phase shift of behavioural rhythm. Furthermore, at an abrupt shift of the light-dark cycle, BMAL1 DN (+) rat showed faster entrainment to the new light-dark cycle compared to controls. The circadian rhythm has been regarded as a limit cycle phenomenon, and our results support the hypothesis that modification of the amplitude of the circadian limit cycle leads to alteration in the length of the phase shift.

The basement membrane (BM), with collagen IV as a major component, plays an important role in the maintenance of muscle structure and its robustness. To investigate the effects of aging on factors related to BM construction, we compared the expression status of these factors in 3- and 20-month-old male Wistar rats. The expression levels of Col4a1 and Col4a2 (encoding collagen IV), Sparc (involved in collagen IV functionalization), and Mmp14 (a collagen IV degradation factor) were decreased. These results suggest that aging suppresses collagen IV synthetic and degradative factors and affects BM-related factors in the steady state.

Light is an important cue for resetting the circadian clock. In mammals, light signals are thought to be transmitted to the cAMP response element (CRE) via a binding protein (CREB) to induce the expression of Per1 and Per2 genes in the mammalian circadian pacemaker, the suprachiasmatic nuclei (SCN). Several in vitro studies have suggested candidate CRE sites that contribute to the Per1 and Per2 induction by light, resulting in a phase shift of the circadian rhythm. However, it remains unclear whether the CREs are responsible for the light-induced Per1/2 induction. To address this question, we generated CRE-deleted mice in the Per1 and Per2 promoter regions. Deletion of a cAMP-responsive CRE in the Per1 promoter blunted light-induced Per1 expression in the SCN at night, while deletion of an ATF4 (CREB-2)-associated CRE in the Per2 promoter had no effect on its expression. These results suggested that the CRE in the Per1 promoter works for light induction but not CRE in the Per2 promoter. Behavioral rhythms observed under some light conditions were not affected by the CRE-deletion in Per1 promoter, suggesting that the attenuated Per1 induction did not affect the entrainment in some light conditions.

PURPOSE: Collagen IV is a component of the basement membrane (BM) that provides mechanical support for muscle fibers. In addition, transcription factor 4 (TCF4) is highly expressed in muscle connective tissue fibroblasts and regulates muscle regeneration. However, the expression of collagen IV and TCF4 (+) cells in response to exercise-induced muscle injury is not well known. Here, we investigated the expression and localization of collagen IV and TCF4 (+) cells during the recovery process after muscle injury induced by different exercise loads. MATERIALS AND METHODS: Muscle injury was observed in the soleus muscle of young Wistar rats after 12 or 18 sets-downhill running (DR) on a treadmill. After running, the rats were permitted to recover for a period of 0.5 days, 2 days, or 7 days. RESULTS: Ectopic localization of collagen IV in injured muscle fibers was observed after DR, and the number increased at 0.5 days after 18 sets DR and at 2 days after 12 or 18 sets DR as compared to the number observed at baseline. BM disruption was observed after DR. TCF4 (+) cells appeared in the inside and around injured muscle fibers at 0.5 day of recovery. After 18 sets DR, TCF4 (+) cells were more abundant for a longer period than that observed after 12 sets DR. CONCLUSIONS: DR induces BM disruption accompanied by muscle fiber damage. It is possible that BM destruction may be accompanied by muscle damage and that TCF4 (+) cells contribute to muscle fiber and BM recovery.

Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders. Among the most common manifestations of PD are sleep problems, which are coupled with the adverse effects of dopaminergic therapies (DT). A non-pharmacological solution for these sleep problems has been sought to avoid additional pharmacological intervention. Here, we show that bright light therapy (BLT) is effective for improving sleep in Japanese PD patients receiving DT. Furthermore, experimental evaluation of peripheral clock gene expression rhythms revealed that most PD patients receiving DT who experienced improved sleep following BLT showed a circadian phase shift, indicating the existence of a correlation between circadian modulation and sleep improvement. Conversely, this result indicates that sleep problems in PD patients receiving DT may arise at least in part as a result of circadian dysfunction. Indeed, we found that chronic dopaminergic stimulation induced a rapid attenuation of autonomous oscillations of clock gene expression in ex vivo cultured mouse suprachiasmatic nucleus (SCN) at the single neuron level. In conclusion, BLT is a promising medical treatment for improving sleep in PD patients receiving DT. This BLT-induced improvement may be due to the restoration of circadian function.

Entrainment of mammalian circadian rhythms requires receptor-mediated signaling in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), the site of the master circadian pacemaker. Receptor-mediated signaling is regulated by endocytosis, indicating that endocytosis-related proteins contribute to SCN pacemaking. Sorting nexin 25 (SNX25) belongs to the sorting nexin superfamily, whose members are responsible for membrane attachment to organelles of the endocytic system. In this study, we showed that Snx25 mRNA and SNX25 protein are highly expressed and exhibit remarkable circadian rhythms in the SCN of adult mice. Expression was maximal at about zeitgeber time (ZT) 16 in the subjective night and minimal at ZT8 in the subjective day. Prominent SNX25 immunoreactivity was found in the arginine vasopressin-positive neurons of the SCN. These findings suggest that SNX25 is a new actor in endocytic signaling, perhaps contributing to the circadian pacemaking system.

Purpose: Elevated IOP can cause the development of glaucoma. The circadian rhythm of IOP depends on the dynamics of the aqueous humor and is synchronized with the circadian rhythm pacemaker, that is, the suprachiasmatic nucleus. The suprachiasmatic nucleus resets peripheral clocks via sympathetic nerves or adrenal glucocorticoids. However, the detailed mechanisms underlying IOP rhythmicity remain unclear. The purpose of this study was to verify this regulatory pathway. Methods: Adrenalectomy and/or superior cervical ganglionectomy were performed in C57BL/6J mice. Their IOP rhythms were measured under light/dark cycle and constant dark conditions. Ocular administration of corticosterone or norepinephrine was also performed. Localization of adrenergic receptors, glucocorticoid receptors, and clock proteins Bmal1 and Per1 were analyzed using immunohistochemistry. Period2::luciferase rhythms in the cultured iris/ciliary bodies of adrenalectomized and/or superior cervical ganglionectomized mice were monitored to evaluate the effect of the procedures on the local clock. The IOP rhythm of retina and ciliary epithelium-specific Bmal1 knockout mice were measured to determine the significance of the local clock. Results: Adrenalectomy and superior cervical ganglionectomy disrupted IOP rhythms and the circadian clock in the iris/ciliary body cultures. Instillation of corticosterone and norepinephrine restored the IOP rhythm. β2-Adrenergic receptors, glucocorticoid receptors, and clock proteins were strongly expressed within the nonpigmented epithelia of the ciliary body. However, tissue-specific Bmal1 knock-out mice maintained their IOP rhythm. Conclusions: These findings suggest direct driving of the IOP rhythm by the suprachiasmatic nucleus, via the dual corticosterone and norepinephrine pathway, but not the ciliary clock, which may be useful for chronotherapy of glaucoma.

ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 2 (ST8SIA2) synthesizes polysialic acid (PSA), which is essential for brain development. Although previous studies reported that St8sia2-deficient mice that have a mixed 129 and C57BL/6 (B6) genetic background showed mild and variable phenotypes, the reasons for this remain unknown. We hypothesized that this phenotypic difference is caused by diversity in the expression or function of flanking genes of St8sia2. A genomic polymorphism and gene expression analysis in the flanking region revealed reduced expression of insulin-like growth factor 1 receptor (Igf1r) on the B6 background than on that of the 129 strain. This observation, along with the finding that administration of an IGF1R agonist during pregnancy increased litter size, suggests that the decreased expression of Igf1r associated with ST8SIA2 deficiency caused lethality. This study demonstrates the importance of gene expression level in the flanking regions of a targeted null allele having an effect on phenotype.

The suprachiasmatic nucleus (SCN) is the center of the mammalian circadian system. Environmental photic signals shifts the phase of the circadian rhythm in the SCN except during the dead zone, when the photic signal is gated somewhere on the way from the retina to the neurons in the SCN. Here we examined the phase of the dead zone after an abrupt delay of the LD cycles for several days by observing the mc-Fos induction in the SCN by light pulses. After an abrupt shift of the LD cycles, the dead zone showed a slow phase shift, about two hours per day, which was well corresponded with the slow phase shift of the rest-activity cycles. In our previous study we demonstrated that, after an abrupt shift of the LD cycles, the SCN showed transient endogenous desynchronization between shell and core regions that showed a slow and a rapid shift of the circadian rhythms, respectively. Therefore, the present findings on the phase shift of the dead zone after the LD cycles shift suggest that the phase of the dead zone is under the control of the timing signals from the shell region of the SCN.

In mammals, the central circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus and it orchestrates peripheral clocks in the whole body to organize physiological and behavioral rhythms. Light-induced phase-shift of the SCN clock enables synchronization of the circadian clock system with 24-h environmental light/dark cycle. We previously found that adenosine deaminase acting on RNA 2 (Adar2), an A-to-I RNA editing enzyme catalyzing rhythmic A-to-I RNA editing, governs a wide range of mRNA rhythms in the mouse liver and regulates the circadian behavior. In brain, ADAR2-mediated A-to-I RNA editing was reported to occur in various transcripts encoding ion channels and neurotransmitter receptors, which could influence neuronal function of the SCN. Here we show that ADAR2 plays a crucial role for light-induced phase-shift of the circadian clock. Intriguingly, exposure of Adar2-knockout mice to a light pulse at late night caused an aberrant phase-advance of the locomotor rhythms. By monitoring the bioluminescence rhythms of the mutant SCN slices, we found that a phase-advance induced by treatment with pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) was markedly attenuated. The present study suggests that A-to-I RNA editing in the SCN regulates a proper phase response to light in the mouse circadian system.

Sleep regulation involves interdependent signaling among specialized neurons in distributed brain regions. Although acetylcholine promotes wakefulness and rapid eye movement (REM) sleep, it is unclear whether the cholinergic pathway is essential (i.e., absolutely required) for REM sleep because of redundancy from neural circuits to molecules. First, we demonstrate that synaptic inhibition of TrkA+ cholinergic neurons causes a severe short-sleep phenotype and that sleep reduction is mostly attributable to a shortened sleep duration in the dark phase. Subsequent comprehensive knockout of acetylcholine receptor genes by the triple-target CRISPR method reveals that a similar short-sleep phenotype appears in the knockout of two Gq-type acetylcholine receptors Chrm1 and Chrm3. Strikingly, Chrm1 and Chrm3 double knockout chronically diminishes REM sleep to an almost undetectable level. These results suggest that muscarinic acetylcholine receptors, Chrm1 and Chrm3, are essential for REM sleep.

Chronic circadian disruption due to shift work or frequent travel across time zones leads to jet-lag and an increased risk of diabetes, cardiovascular disease, and cancer. The development of new pharmaceuticals to treat circadian disorders, however, is costly and hugely time-consuming. We therefore performed a high-throughput chemical screen of existing drugs for circadian clock modulators in human U2OS cells, with the aim of repurposing known bioactive compounds. Approximately 5% of the drugs screened altered circadian period, including the period-shortening compound dehydroepiandrosterone (DHEA; also known as prasterone). DHEA is one of the most abundant circulating steroid hormones in humans and is available as a dietary supplement in the USA Dietary administration of DHEA to mice shortened free-running circadian period and accelerated re-entrainment to advanced light-dark (LD) cycles, thereby reducing jet-lag. Our drug screen also revealed the involvement of tyrosine kinases, ABL1 and ABL2, and the BCR serine/threonine kinase in regulating circadian period. Thus, drug repurposing is a useful approach to identify new circadian clock modulators and potential therapies for circadian disorders.

In mammals, the principal circadian oscillator exists in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN). In the SCN, CLOCK works as an essential component of molecular circadian oscillation, and ClockΔ19 mutant mice show unique characteristics of circadian rhythms such as extended free running periods, amplitude attenuation, and high-magnitude phase-resetting responses. Here we investigated what modifications occur in the spatiotemporal organization of clock gene expression in the SCN of ClockΔ19 mutants. The cultured SCN, sampled from neonatal homozygous ClockΔ19 mice on an ICR strain comprising PERIOD2::LUCIFERASE, demonstrated that the Clock gene mutation not only extends the circadian period, but also affects the spatial phase and period distribution of circadian oscillations in the SCN. In addition, disruption of the synchronization among neurons markedly attenuated the amplitude of the circadian rhythm of individual oscillating neurons in the mutant SCN. Further, with numerical simulations based on the present studies, the findings suggested that, in the SCN of the ClockΔ19 mutant mice, stable oscillation was preserved by the interaction among oscillating neurons, and that the orderly phase and period distribution that makes a phase wave are dependent on the functionality of CLOCK.

Aging is known to lead to the impaired recovery of muscle after disuse as well as the increased susceptibility of the muscle to damage. Here, we show that, in the older rats, reloading after disuse atrophy, causes the damage of the muscle fibers and the basement membrane (BM) that structurally support the muscle fibers. Male Wistar rats of 3-(young) and 20-(older) months of age were subjected to hindlimb-unloading for 2weeks followed by reloading for a week. In the older rats, the soleus muscles showed necrosis and central nuclei fiber indicating the regeneration of muscle fibers. Furthermore, ectopic immunoreactivity of collagen IV, a major component of the BM, remained mostly associated with the necrotic appearance, suggesting that the older rats were impaired with the ability of repairing the damaged BM. Further, after unloading and reloading, the older rats did not show a significant alteration, although the young rats showed clear response of Col4a1 and Col4a2 genes, both coding for collagen IV. In addition, during the recovery phase, the young rats showed increase in the amount of Hsp47 and Sparc mRNA, which are protein folding-related factor genes, while the older rats did not show any significant variation. Taken together, our findings suggest that the atrophic muscle fibers of the older rats induced by unloading were vulnerable to the weight loading, and that attenuated reactivity of the BM-synthesizing fibroblast to gravity contributes to the fragility of muscle fibers in the older animals.

Most biological processes accelerate with temperature, for example cell division. In contrast, the circadian rhythm period is robust to temperature fluctuation, termed temperature compensation. Temperature compensation is peculiar because a system-level property (i.e., the circadian period) is stable under varying temperature while individual components of the system (i.e., biochemical reactions) are usually temperature-sensitive. To understand the mechanism for period stability, we measured the time series of circadian clock transcripts in cultured C6 glioma cells. The amplitudes of Cry1 and Dbp circadian expression increased significantly with temperature. In contrast, other clock transcripts demonstrated no significant change in amplitude. To understand these experimental results, we analyzed mathematical models with different network topologies. It was found that the geometric mean amplitude of gene expression must increase to maintain a stable period with increasing temperatures and reaction speeds for all models studied. To investigate the generality of this temperature-amplitude coupling mechanism for period stability, we revisited data on the yeast metabolic cycle (YMC) period, which is also stable under temperature variation. We confirmed that the YMC amplitude increased at higher temperatures, suggesting temperature-amplitude coupling as a common mechanism shared by circadian and 4 h-metabolic rhythms.

Both prokineticin receptor 2 (pkr2) and prokineticin 2 (pk2) gene-deficient mice have hypoplasia of the main olfactory bulb (MOB). This hypoplasia has been attributed to disruption of the glomerulus that is caused by loss of afferent projection from olfactory sensory neurons (OSN), and to the impaired migration of granule cells, a type of interneuron. In the present study, we examined whether migration of the second type of interneuron, periglomerular cells (PGC), is dependent on the pkr2 expression by observing the localization of distinct subpopulations of PGC: calretinin (CR)-, calbindin (CB)- and tyrosine hydroxylase (TH)-expressing neurons. In the Pkr2-/- mice, the construction of the layered structure of the MOB was partially preserved, with the exception of the internal plexiform layer (IPL) and the glomerular layer (GL). In the outermost layer of the MOB, abundant CR- and CB-immunopositive neurons were observed in the hypoplastic olfactory bulb. In addition, although markedly decreased, TH-immunopositive neurons were also observed in the outermost cell-dense region in the Pkr2-/-. The findings suggest that the migration of PGC to the MOB, as well as the migration from the core to the surface region of the MOB, is not driven by the PK2-PKR2 system.

The circadian system has been regarded as a limit cycle oscillator constructed by the integrated interaction of clock genes and proteins. Here, we investigated a mammalian circadian oscillation geometrically before and after a perturbation. We detected the singular point and transition from a type 1 to type 0 phase response curve (PRC) and determined the embedding dimension to show how many variables are needed to describe the limit cycle oscillation and relaxation process after a perturbation. As a perturbation, forskolin (FK) was administered to Rat-1 cells expressing the Per2::luc gene. By broadly and finely changing the phase and strength of the perturbation, we detected the transition of the PRC from type 1 to type 0 and a possible singular transition point, the property of which agreed quite well with our numerical simulation of the noisy Goodwin model, a simple yet canonical model for the transcription-translation feedback loop of the core clock genes. Furthermore, we estimated the embedding dimension of the limit cycle before and after the perturbation. The trajectory of the limit cycle was embedded in two dimensions but with the perturbation of the state point moved out of the trajectory, the relaxation process was generally embedded in higher dimensions. The average number of embedding dimensions at each dose of FK increased as the FK dose increased but most of the relaxation process was generally embedded within four dimensions. These findings support the existence of a circadian limit cycle oscillator in mammalian cells and suggest that a small number of variables determine the relaxation process after a perturbation.

General anesthesia affects the expression of clock genes in various organs. Expression of Per2, a core component of the circadian clock, is markedly and reversibly suppressed by sevoflurane in the suprachiasmatic nucleus (SCN), and is considered to be a biochemical marker of anesthetic effect in the brain. The SCN contains various types of neurons, and this complexity makes it difficult to investigate the molecular mechanisms of anesthesia. Here, we established an in vitro experimental system using a cell line to investigate the mechanisms underlying anesthetic action. Development of the system comprised two steps: first, we developed a system for application of inhalational anesthetics and incubation; next, we established cultures of anesthetic-responsive cells expressing mPer2 promoter-dLuc. GT1-7 cells, derived from the mouse hypothalamus, responded to sevoflurane by reversibly decreasing mPer2-promoter-driven bioluminescence. Interestingly, the suppression of bioluminescence was found only in the serum-starved GT1-7 cells, which showed neuron-like morphology, but not in growing cells, suggesting that neuron-like characteristics are required for anesthetic effects in GT1-7 cells.

Sprague-Dawleyラットを対照群、後肢非荷重群(尾懸垂2週間)、再荷重群(尾懸垂解放後1週間)に分け、実験開始2〜3週後に麻酔下で体重測定、ヒラメ筋摘出を行い、筋線維タイプ別の毛細血管-筋線維比、単一筋線維周囲の毛細血管数、筋断面積を計測した。非荷重群では体重、ヒラメ筋質量、相対筋質量(筋質量/体重)、全筋線維タイプの筋横断面積は対照群に比べ有意に減少した。再荷重群ではヒラメ筋質量、相対筋質量、全筋線維タイプの筋横断面積は非荷重群に比べ有意に増加した。単一筋線維当たりの毛細血管-筋線維比は非荷重群で有意に低下し、再荷重群では非荷重群に比べ1週間目までは有意な増加を認めなかった。タイプI、IICの線維周囲毛細血管数は非荷重群で有意に減少したが、タイプI線維周囲の毛細血管数は1週間の再荷重で有意に増加したが、タイプIIC線維周囲の毛細血管数は有意な増加を示さなかった。

Measuring real-time gene activity in the brains of freely moving animals presents a challenging issue in neuroscience research. Circadian gene expression in neurons of the suprachiasmatic nucleus (SCN), a small nucleus in the hypothalamus, is reflected in behavioral rhythmicity. Cellular oscillatory gene expression is generated by a transcription-translation feedback loop of clock genes including 2 oscillatory genes, Per1 and Per2. Here we have succeeded in real-time monitoring of Per1 and Per2 transcription separately by detecting the bioluminescence of luciferase (luc) reporters using a plastic optical fiber inserted into the SCN of freely moving rats. Per1-luc and Per2-luc rhythms peaked in the middle and late subjective day, respectively, which was confirmed by quantitative PCR-based measurements of SCN tissue samples. Studies of in vivo transcriptional states of clock genes in freely moving animals should improve our understanding of how clock gene expression is reflected in behavior.

Cellular oscillators in the uterus play critical roles in the gestation processes of mammals through entraining of the clock proteins to numerous downstream genes, including growth/differentiation factor (Gdf)10 and Gdf15. The expression of Gdf10 and Gdf15 is significantly increased in the uterus during decidualization, but the mechanism underlying the regulation of Gdf gene expression in the uterus is poorly understood. Here, we focused on the function of the cellular oscillators in the expression of Gdf family by using uterine endometrial stromal cells (UESCs) isolated from pregnant Per2-dLuc transgenic rats. A significant decline of Per2-dLuc bioluminescence activity was induced in in vitro decidualized UESCs, and concomitantly the expression of canonical clock genes was downregulated. Conversely, the expression of Gdf10 and Gdf15 of the Gdf was upregulated. In UESCs transfected with Bmal1-specific siRNA, in which Rev-erbα expression was downregulated, Gdf10 and Gdf15 were upregulated. However, Gdf5, Gdf7, and Gdf11 were not significantly affected by Bmal1 silencing. The expression of Gdf10 and Gdf15 was enhanced after treatment with a REV-ERBα antagonist in the presence or absence of progesterone. Chromatin immunoprecipitation-PCR analysis revealed the inhibitory effect of REV-ERBα on the expression of Gdf10 and Gdf15 in UESCs by recognizing their gene promoters. Collectively, our findings indicate that the attenuation of REV-ERBα leads to an upregulation of Gdf10 and Gdf15 in decidual cells, in which cellular oscillators are impaired. Our results provide novel evidence regarding the functions of cellular oscillators regulating the expression of downstream genes during the differentiation of UESCs.

In the intracellular environment, the circadian oscillator is exposed to molecular noise. Nevertheless, cellular rhythms are robust and show almost constant period length for several weeks. To find which molecular processes modulate the stability, we examined the effects of a sublethal dose of inhibitors for processes in the molecular clock. Inhibition of PER1/2 phosphorylation by CKIε/δ led to reduced amplitude and enhancement of damping, suggesting that inhibition of this process destabilized oscillation. In contrast, moderate inhibition of translation led to stabilization of the circadian oscillation. Moreover, inhibition of translation also reduced magnitude of phase shift. These results suggest that some specific molecular processes are crucial for stabilizing the circadian rhythm, and that the molecular clock may be stabilized by optimizing parameters of some crucial processes in the primary negative feedback loop. Moreover, our findings also suggested that rhythm stability is closely associated with phase stability against stimuli.

The rhythmic expression of clock genes in the uterus is attenuated during decidualization. This study focused on Ptgs2, which is essential for decidualization, as a putative clock-controlled gene, and aimed to reveal the functions of clock genes in relation to Ptgs2 during decidualization. We compared the transcript levels of clock genes in the rat uterus on days 4.5 (D4.5) and 6.5 of pregnancy. The transcript levels of clock genes (Per2, Bmal1, Rorα, and Rev-erbα) had decreased at implantation sites on day 6.5 (D6.5e) compared with those on D4.5, whereas Ptgs2 transcripts had increased on D6.5e. Similar observations of Rev-erbα and Ptgs2 were also obtained in the endometrium on D6.5e by immunohistochemistry. In the decidual cells induced by medroxyprogesterone and 2-O-dibutyryl-cAMP, the rhythmic expression levels of clock genes were attenuated, whereas Ptgs2 transcription was induced. These results indicate that decidualization causes the attenuation of clock genes and the induction of Ptgs2. Furthermore, in the experiment of Bmal1 siRNA, the rhythmic expression of clock genes and Ptgs2 was attenuated by the siRNA. Transcript levels of Ptgs2 and prostaglandin (PG)E₂ production were increased by treatment with the Rev-erbα antagonist, suggesting the contribution of the nuclear receptor Rev-erbα to Ptgs2 expression. Moreover, Rev-erbα knockdown enhanced the induction of Ptgs2 transcription and PGE₂ production by forskolin. Chromatin immunoprecipitation-PCR analysis revealed that Rev-erbα could directly bind to a proximal RORE site of Ptgs2. Collectively, this study demonstrates that the attenuation of the circadian clock, especially its core component Rev-erbα, contributes to the induction of Ptgs2 during decidualization.

Uterus circadian rhythms have been implicated in the gestation processes of mammals through entraining of the clock proteins to numerous downstream genes. Bone morphogenetic proteins (BMPs), having clock-controlled regulatory sites in their gene promoters, are expressed in the uterus during decidualization, but the regulation of the Bmp gene expression is poorly understood. The present study was designed to dissect the physiological roles of the uterus oscillators in the Bmp expression using the uterus endometrial stromal cells (UESCs) isolated from Per2-dLuc transgenic rats on day 4.5 of gestation. The in vitro decidualization of UESCs was induced by medroxyprogesterone acetate and 2-O-dibutyryl cAMP. A significant decline of Per2-dLuc bioluminescence activity was induced in decidual cells, and concomitantly, the expression of canonical clock genes was downregulated. Conversely, the expression of the core Bmp genes Bmp2, Bmp4, Bmp6, and Bmp7 was upregulated. In UESCs transfected with Bmal1-specific siRNA, in which Rev-erbα expression was downregulated, Bmp genes, such as Bmp2, Bmp4, and Bmp6 were upregulated. However, Bmp1, Bmp7, and Bmp8a were not significantly affected by Bmal1 silencing. The expression of all Bmp genes was enhanced after treatment with the REV-ERBα antagonist (SR8278), although their rhythmic profiles were differed from each other. The binding of REV-ERBα to the proximal regions of the Bmp2 and Bmp4 promoters was revealed by chromatin immunoprecipitation-PCR analysis. Collectively, these results indicate that the Bmp genes are upregulated by the attenuation of the cellular circadian clock; in particular, its core component REV-ERBα functions as a transcriptional silencer in the Bmp gene family.

The nuclear receptor REV-ERBα links circadian rhythms and numerous physiological processes, but its physiological role in ovaries remains largely unknown. The aim of this study was to determine the potential role of REV-ERBα in the regulation of the transcription of its putative target genes in granulosa cells (GCs) prepared from Per2-destablized luciferase (dLuc) reporter gene transgenic rats. Alas1, Ppargc1a, and Il6 were chosen as representatives for genes analysis. A real-time monitoring system of Per2 promoter activity was performed to detect Per2-dLuc circadian oscillations. Two agonists (GSK4112, heme) and an antagonist (SR8278) of REV-ERBα as well as Rev-erbα siRNA knockdown were used to identify its target genes. Clear Per2-dLuc circadian oscillations were generated in matured GCs after synchronization with GSK4112 or SR8278. GSK4112 treatment lengthened and SR8278 treatment shortened the period of circadian oscillations in matured GCs stimulated with or without luteinizing hormone (LH). GSK4112 showed an inhibitory effect on the amplitude of circadian oscillations and caused an arrhythmic expression of canonical clock genes. SR8278 also had a subtle effect on their daily expression profiles, but the treatment resulted only in the arrhythmic expression of Rev-erbα. These findings indicate the functional biological activity of REV-ERBα in response to its ligands. Its natural ligand heme further elongated the period of circadian oscillations and alleviated their amplitudes in GCs cultured with LH. Heme treatment also repressed the expressions of clock genes, Alas1, Il6, and Ppargc1a. Rev-erbα knockdown up-regulated these transcript levels. Collectively, these data extend the recent finding to rat GCs and demonstrate that REV-ERBα represses the expressions of Alas1, Ppargc1a, and Il6, providing novel insights into the physiological significance of REV-ERBα in ovarian circadian oscillators.

Thyroid-stimulating hormone (TSH; thyrotropin) is a glycoprotein secreted from the pituitary gland. Pars distalis-derived TSH (PD-TSH) stimulates the thyroid gland to produce thyroid hormones (THs), whereas pars tuberalis-derived TSH (PT-TSH) acts on the hypothalamus to regulate seasonal physiology and behavior. However, it had not been clear how these two TSHs avoid functional crosstalk. Here, we show that this regulation is mediated by tissue-specific glycosylation. Although PT-TSH is released into the circulation, it does not stimulate the thyroid gland. PD-TSH is known to have sulfated biantennary N-glycans, and sulfated TSH is rapidly metabolized in the liver. In contrast, PT-TSH has sialylated multibranched N-glycans; in the circulation, it forms the macro-TSH complex with immunoglobulin or albumin, resulting in the loss of its bioactivity. Glycosylation is fundamental to a wide range of biological processes. This report demonstrates its involvement in preventing functional crosstalk of signaling molecules in the body.

The mammalian circadian oscillator is composed of interacting positive and negative transcription events. The clock proteins PER1 and PER2 play essential roles in a negative limb of the feedback loop that generates the circadian rhythm in mammals. In addition, the proteins CLOCK and BMAL1 (also known as ARNTL) form a heterodimer that drives the Per genes via the E-box consensus sequences within their promoter regions. In the present study, we demonstrate that Id2 is involved in stabilization of the amplitudes of the circadian oscillations by suppressing transcriptional activation of clock genes Clock and Bmal1. Id2 shows dynamic oscillation in the SCN, with a peak in the late subjective night. Under constant dark conditions (DD), Id2(-/-) mice showed no apparent difference in locomotor activity, however, under constant light conditions (LL), Id2(-/-) mice exhibit aberrant locomotor activity, with lower circadian oscillation amplitudes, although the free running periods in Id2(-/-) mice show no differences from those in either wild type or heterozygous mice. Id2(-/-) animals also exhibit upregulation of Per1 in constant light, during both the subjective night and day. In wild type mice, Id2 is upregulated by constant light exposure during the subjective night. We propose that Id2 expression in the SCN contributes to maintenance of dynamic circadian oscillations.

The suprachiasmatic nucleus (SCN) is the mammalian circadian rhythm center. Individual oscillating neurons have different endogenous circadian periods, but they are usually synchronized by an intercellular coupling mechanism. The differences in the period of each oscillating neuron have been extensively studied; however, the clustering of oscillators with similar periods has not been reported. In the present study, we artificially disrupted the intercellular coupling among oscillating neurons in the SCN and observed regional differences in the periods of the oscillating small-latticed regions of the SCN using a transgenic rat carrying a luciferase reporter gene driven by regulatory elements from a per2 clock gene (Per2::dluc rat). The analysis divided the SCN into two regions--aregion with periods shorter than 24 h (short-period region, SPR) and another with periods longer than 24 h (long-period region, LPR). The SPR was located in the smaller medial region of the dorsal SCN, whereas the LPR occupied the remaining larger region. We also found that slices containing the medial region of the SCN generated shorter circadian periods than slices that contained the lateral region of the SCN. Interestingly, the SPR corresponded well with the region where the SCN phase wave is generated. We numerically simulated the relationship between the SPR and a large LPR. A mathematical model of the SCN based on our findings faithfully reproduced the kinetics of the oscillators in the SCN in synchronized conditions, assuming the existence of clustered short-period oscillators.

邦人におけるマルチスライスCT(MDCT）を用いた冠動脈の起始異常の発現率および開口部起始位置の幾何学的形態を明らかにした。
分岐異常を有した症例は1,053例中、高位起始症例が0例、左前下行枝と左回旋枝が分離して起始する症例が8例（0.755％）、
右冠動脈が左冠尖から分岐する症例が6例（0.570％）の合計14例（1.330％）認められた。
正常分岐症例のみにおける冠動脈の分岐角度は、左冠動脈に比べ右冠動脈が有意に鈍角で、左右冠動脈間の分離角度は
139.9°±17.3離れて分岐しており、男女間では有意差は無かった。
Valsalva洞底部から冠動脈起始部までの距離は、左冠動脈（10.84mm±2.80）に比べ右冠動脈（11.94mm±3.05）の方が有意に
高い位置で分岐し、男女間では左右冠動脈とも男性の方が高い位置で分岐していた。

哺乳類において、視交叉上核は体内時計の中枢と考えられている。この視交叉上核における各ペプチド含有細胞の分布、出力系、体内時計中枢のリセット（光同調）について形態学的な視点から解説した。また、我々の研究において解明した時差症候群（時差ボケ）の機序について紹介した。

哺乳類における体内時計の場所である視交叉上核とその中に存在する小領域と、体内時計はどうして変位するか。すなわち、日々の時刻合わせがどのようになっているかについて説明し、時差症候群の成り立ちについて説明をする。

視交叉上核（SCN）は，視交叉の直上に存在する一組の神経核であり，哺乳類概日リズムの中枢である．SCN は末梢時計を制御することだけでなく，外界の光環境の変化を認識する機構を備えている．概日リズムはリミットサイクルとよばれる物理現象と考えられており，視交叉上核における概日リズム発振細胞の振る舞いに理論的裏付けを与えている．視交叉上核の時計の位相を大きく変動させる入力は光である．光反応部と非光反応部をそなえる視交叉上核の解剖学的構築が時差ぼけの原因となっている．非光反応部では概日リズムが最大で1 日2 時間程度しかシフトしないため環境の明暗周期に同期するのに日数を要する．これが時差ぼけ（時差症候群）である．また視交叉上核内部には位相波とよばれる現象が現れ，同期を維持しながら日長を振動子間の位相差として視交叉上核内に蓄えるシステムであることが明らかになって来た．

Kallmann症候群は、嗅覚の異常と中枢性性腺機能低下症を合併する病態である。プロキネチシン受容体タイプ２（PKR2） KO マウスは嗅球の形成不全と、中枢性の性腺機能低下症を示した。これは主要２症候を合併する初めてのKallmann症候群モデル動物である。これらの症候群の原因としては、特定の神経細胞のおいてPK2/PKR2システムを介した遊走が、障害されていることが原因である。嗅球の形成については嗅球を構成するニューロンの遊走障害が,性腺機能低下症はGnRHニューロンの遊走障害が原因であると考えられた。

2001年に行われた時間生物学札幌国際シンポジウムのproceedingである。体内時計の中枢である視交叉上核が、光条件に迅速に追随する部分となかなか環境に同調できない2つの領域によってなっており、それが時差ボケを引き起こしていることを述べた。

哺乳類概日リズムの中枢である視交叉上核(SCN)は、構成するそれぞれの神経細胞が固有の周期を持って概日リズムを発振している。細胞間の同期シグナルによって等周期の概日リズムを刻んでいる。一方、位相についてはサブ領域間で異なり、背側部の内側から外側に向かって位相波を生じていることを時計遺伝子Per1, Per2の発現解析により明らかになっている。 SCNの細胞間の同期にはcAMPによる位相伝達が必要であることが報告されていることから、今回、このシグナル伝達系を撹乱した際にSCN内の周期や位相がどのような影響を受けるかについて検索した。 （方法）新生児Per2::Lucラットの冠状断SCNスライスを作製し、その発光を冷却CCDカメラで経時的に記録した。cAMPシグナルを受容体非依存的に活性化するForskolinをSCNに継続的に作用させることで同期シグナルを撹乱した。周期と位相の解析には、SCNが外接するような格子状の長方形を設定し、各領域における発光の振動をsineの減衰

哺乳類体内時計の中枢である視交叉上核（SCN）は構成する神経細胞が同期し、概日のリズムを発振する。これらの細胞は個々に解離した状態では様々な周期を示すことが知られているが、それらがSCNでどのように分布しているかは不明であった。我々はラットPer2::lucのSCNスライスにcAMP合成酵素であるアデニル酸シクラーゼを活性化するホルスコリンを継続的に添加した際の周期への影響を測定した。観察したSCNの画像を格子状に分割し、それぞれの区画においてlucの発光が示す振動を解析すると、SCNの同期状態が失われていることを発見した。この時、24h未満の周期を持つ短周期の領域（SPR）はSCNの内側の小領域に限局し、24時間よりも長周期の領域（LPR）は外側に存在するという領域特異性を持っていた。興味深いことに、SPRはSCNでPerの発現が内側から外側へと位相差を持って伝播する位相波の起点領域と一致していた。また、Per1, Per2の発現解析からこの位相差は短日条件から長日条件

哺乳類において、主観的夜の光照射は概日リズムのシフトを生じ、その際には視交叉上核にてPer遺伝子の誘導に伴いシフトが生じると考えられている。一方、主観的昼の光照射に対しては概日リズム位相は変化せず、主観的夜の光照射で誘導されるcfos、Per1遺伝子誘導も生じない。このように光入力があっても視交叉上核がシフトしない機構(ゲート)についてはその機序がほとんど明らかになっていない。今回、このゲート位相を規定しているのが視交叉上核の背内側部(光非反応領域)か腹外側部(光反応領域)かを検討した。そのために明暗サイクルを10時間後退させて腹外側部と背内側部を脱同期させ、その後恒暗条件下で１、3，7日目(シフト当日を１日目)に、あるいは明暗条件を保ったまま１日目から4日目までの暗期に２時間おきに30分間光照射を行った後サンプルを採取し、視交叉上核におけるcfos、Per1遺伝子の誘導を in situ hybridization法を用いて観察した。その結果は背内側部がゲート

哺乳類体内時計における最大の同調因子は光である。しかしながら視交叉上核(SCN)において光の変化、強さ、長さ等の情報がどのように表現されているのか、その詳細は明らかではない。そこでこの問題を明らかにするために、恒暗条件下のマウスに主観的夜の前半及び後半で光照射を与えた後、SCNに発現するRNAを抽出し、GeneChipを用いて光応答遺伝子の包括的解析を行った。その結果、光照射後に発現が上昇する240遺伝子及び発現が抑制される45遺伝子を同定した。さらに光照射後に発現が上昇する遺伝子群に対して主成分分析を行った結果、光照射30分後に発現がピークに達し急速に減少する遺伝子(early type)と、120分後に発現がピークに達しゆっくりと減少する遺伝子(late type)の2つの反応パターンがあることを見出した。その反応パターンよりearly typeは光の変化、late typeは光の強さ、長さを感知しているのではないかと考え、マウスに光の長時間照射を与えたところ、SCNにおいてearly type

ほとんどの生物は、その体内に生物時計を持ち、内因性の慨日リズムにしたがっ て生活しているが、活動や休息の時間帯は種によって異なる。たとえば、夜行性 のマウスは主に夜間に活動するが、昼行性である我々ヒトは昼間に活動する。哺 乳類の体内時計の中枢は、脳の視床下部にある視交叉上核である。視交叉上核内 で作り出された慨日リズムが、睡眠・覚醒や体温などの生理的リズムとなってあ らわれる。しかし、昼行性動物も夜行性動物も、視交叉上核のリズム（電気活 動・代謝）は同じであることが報告されている。時計遺伝子の発見と解析が進 み、哺乳類の体内時計システムは、視交叉上核を頂点とした階層性を持つことが 判明した。だが、遺伝子発現レベルでの知見はほとんどが夜行性動物により得ら れたもので、昼行性動物での調査はあまり進んでおらず、活動・休息時間帯を決 定するメカニズムもいまだにわかっていない。哺乳類体内時計

ほとんどの生物は、その体内に生物時計を持ち、内因性の慨日リズムにしたがっ て生活しているが、活動や休息の時間帯は種によって異なる。たとえば、夜行性 のマウスは主に夜間に活動するが、昼行性である我々ヒトは昼間に活動する。哺 乳類の体内時計の中枢は、脳の視床下部にある視交叉上核である。視交叉上核内 で作り出された慨日リズムが、睡眠・覚醒や体温などの生理的リズムとなってあ らわれる。しかし、昼行性動物も夜行性動物も、視交叉上核のリズム（電気活 動・代謝）は同じであることが報告されている。時計遺伝子の発見と解析が進 み、哺乳類の体内時計システムは、視交叉上核を頂点とした階層性を持つことが 判明した。だが、遺伝子発現レベルでの知見はほとんどが夜行性動物により得ら れたもので、昼行性動物での調査はあまり進んでおらず、活動・休息時間帯を決 定するメカニズムもいまだにわかっていない。哺乳類体内時計

視交叉上核における周期の異なる２振動体とそれによって生じる視交叉上核内の位相波について数理モデルを構築し発表した。

視交叉上核における時差ぼけと視交叉上核背側部の周期の異なる領域について述べた。

世界初のKallmann症候群モデルであるPkr2 KOマウスの病態について述べた。

体内時計研究で特にヒトにおける疾患に特有の病態について述べた。具体的には概日リズム睡眠障害、時差ぼけの病態について概説した

視交叉上核背内側部における２振動体についての現状の報告を行った。

最新の64ch MDCTを用いた心臓CT検査のための被ばく低減技術の策略と応用事例の報告

視交叉上核からの位相情報を末梢時計に伝える主要な因子の１つに、グルココ ルチコイドがある。我々は末梢時計の位相制御におけるグルココルチコイドの関 与を調べるために、以下の実験を行った。 内因性のグルココルチコイドの影響を避けるため、実験にはADXラットを用い た。7日間にわたり、本来の内因性リズムとは逆位相であるZT0.5にコルチコステ ロン3mg/kgまたは27mg/kgを投与し、7日目にサンプリングを行った。肝臓、腎臓 のrPer1, rPer2, rCry1, rBmal1mRNA量を測定したところ、肝臓ではいずれの遺 伝子の発現リズムの位相も対照群と変化が見られなかった。しかし、腎臓では rPer2, rCry1, rBmal1の遺伝子発現リズムが対照群とは逆位相に変化していた。 肝臓の末梢時計は位相の変化が見られなかったことから、他の同調因子によって 位相が固定されていることが示された。我々はこの同調因子を摂食性のものと考 え、次にZT4-7の制限給餌とZT11.5のコルチコステロ

プロキネティシン受容体2を欠損したKOマウスでは嗅球での発生異常が生じる。とくに、糸球体層が欠損することが特徴的である。今回、このKOマウスにおける嗅球ドーパミン細胞は、成体では、野生型と比較して、細胞数が減少している。このドーパミン細胞の発生時の異常について検討を行った。ドーパミンニューロンを検出するためには、ドーパミンの合成酵素であるチロシン水酸化酵素の抗体を用いた。KOマウスの嗅球において、胎生13.5日, 16.5日では陽性細胞の数、サイズにおいて、野生型マウス（WT）との差は無かった。しかし、出生後１日では、野生型で明らかな数およびサイズの増大があったのに対して、WTでは、胎生期との変化はほとんど無かった。これは、嗅球ドーパミン細胞の主な障害は遊走時の障害ではなく、嗅球における成熟の異常であることを示唆する。

視交叉上核の腹外側部と背内側部の同期を保つメカニズムを明らかにするために、micropunchを用いてDMSCNとVLSCNのRNAを採取し、広範囲の遺伝子発現分析を行った。その結果、VIPとVpac2レセプターが抽出された。in situ hybridizationによってVIPとVpac2レセプターmRNAがVLSCNとDMSCNに限定されることが証明された。培養SCNにVIPとVPAC2作用薬を作動させた。すると、DMSCNとVLSCNを分離することによって、DMSCNのみ10時間もの大きなシフトを示した。VIPとVpac2システムがおそらくLDサイクル・シフトの後の視交叉上核再同期のメディエーターであることを示唆する。

時差ぼけの際に体内時計中枢である視交叉上核の腹外側部と背内側部の脱同期が生じる。それが同期状態になるまでに要する期間が前進して同期する場合と、後退して同期する場合で異なることが知られている。この現象について、シミュレーションによって、解析を行った。

視交叉上核(SCN)は網膜から直接投射する腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に分けられ、これらが強固に同期していることが知られている。しかし、SCN組織切片を作製し、長期間培養すると安定した振動の後に、やがて振動の減衰が観察される。このことは薬物添加による再同調では振動が回復することから、細胞間の脱同期の結果と考えられる。 今回、SCN切片作製後に各領域の周期変化を追跡することで、細胞間がどのように脱同期するかを観察した。実験はmPer2::lucラットのSCN組織培養を作製し、細胞レベルの発光をCCDカメラによって経時的に捉えることによって周期を測定した。 この結果、切片作製僅か数日後において周期が大きく異なる細胞が現れた。このときDMSCNの最背側部では24時間よりも短い周期の細胞が、またVLSCNでは24時間よりも長周期の細胞が存在した。さらに新生児SCNにおいて同様の解析を行ったところ、成体とは異なりDM-VL間は切片作製後も長期間同期

すでにC6細胞、および視交叉上核におけるsynaptotagmin17(SYT17) mRNA の概日リズムについて報告した。本研究ではSYT17タンパクの局在について検討した。SYT17抗体による免疫電顕では、C6細胞細胞体の小胞膜および、細胞突起の細胞膜とその直下の小胞膜上にSYT17を検出した。視交叉上核では、視交叉上核全体に広く発現し、さらに外側に伸びる突起にも陽性反応を観察した。GFAP抗体との二重染色では、視交叉上核の多くの細胞でGFAP,SYT17の共発現を示した。アストロサイトでのSYT17の発現が示唆された。

RNA binding motif protein 3(Rbm3)はRNA結合モチーフを持つ遺伝子で、視交叉上核や肝臓で、発現に概日リズムを示すことが知られている。本研究では概日リズム制御に関与する遺伝子の解析法を確立し、Rbm3遺伝子の機能解析を試みた。Rbm3はPer1-3’UTRを介してPer1の転写後調節を行い、概日リズムの自由継続周期を制御することが示唆された。

視交叉上核(SCN)の個々の神経細胞は細胞間同期が存在しなければ、多様な周期の概日リズムを発振することが明らかになっている。よって、SCNが単一周期を発振するためには細胞間の同期を必要とする。今回、ペプチド受容体の局在を検討することによってSCNにおける領域間同期機構を検討した。SCNは、網膜からの投射がある腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に区分され、VLSCNにはVIP、GRP産生細胞が、DMSCNにはAVP産生細胞が局在する。そこで、これらの受容体であるVIP受容体 (VPAC2)、AVP受容体(V1a)、GRP受容体(GRPR)の局在をin situ hybridization 法を用いてラットSCNにおいて検討した。その結果、V1a mRNA発現細胞は主にDMSCNに強く発現した。また、VPAC2 mRNA発現細胞はDMSCNおよびVLSCN内の背側領域、GRPR mRNA発現細胞はVLSCNに密に局在した。これらの結果は、VIP産生細胞がVLSCNからDMSCNへの情報伝達に関与していることを示す。さらにAVPとGRP産生細胞はそれぞれDMSCNおよび、VLSCNにおけるautocrineまたはpara

プロキネティシン受容体2を欠損したKOマウスでは嗅球での発生異常が生じる。とくに、糸球体層が欠損することが特徴的である。今回、このKOマウスにおける嗅球ドーパミン細胞は、成体では、野生型と比較して、細胞数が減少している。このドーパミン細胞の発生時の異常について検討を行った。ドーパミンニューロンを検出するためには、ドーパミンの合成酵素であるチロシン水酸化酵素の抗体を用いた。KOマウスの嗅球において、胎生13.5日, 16.5日では陽性細胞の数、サイズにおいて、野生型マウス（WT）との差は無かった。しかし、出生後１日では、野生型で明らかな数およびサイズの増大があったのに対して、WTでは、胎生期との変化はほとんど無かった。これは、嗅球ドーパミン細胞の主な障害は遊走時の障害ではなく、嗅球における成熟の異常であることを示唆する。

C6細胞において、Dex刺激後、synaptotagmin17(SYT17) mRNA の概日リズムを検出した。刺激後16時間および40時間をピークとする振動であった。同様な振動は視交叉上核(SCN)でも認められ、夜に高く昼に低い発現を得た。。SYT17はCa2+依存的に小胞の膜融合に働くと考えられている。Astrogliaからは神経伝達物質であるglutamateが放出されることも知られており, 日内変動を持って発現するSyt17は、何らかの液性因子の日内変動を示す分泌に関与しているかもしれない。

体内時計の中枢である視交叉上核(SCN)は、網膜からの投射がある腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に区分される。急激な明暗サイクルのシフトに対してVLSCNの概日リズムは１日で新しい明暗条件に同調するが、DMSCNはより日数を費やして位相変位して再同調に至る。この再同調は、VLSCNの位相にDMSCNが引き込まれる様式になっており、VLSCNから DMSCNへの一方向性の位相情報の伝達様式を示唆する。そこで、VLSCNからDMSCNへ作用する伝達物質を同定するために各領域の包括的遺伝子解析を行い、DMSCNに有意に高く発現している遺伝子を検索した。その結果、VIPの受容体であるVPAC2がDMSCNに強く発現していた。さらに、in situ hybridization法によってVPAC2 mRNA発現細胞はDMSCNのみに密に存在することが確認できた。VLSCNにはVIPが強く発現していることから、VLSCNからDMSCNにVIPがVPAC2受容体を介して位相情報の伝達を行っていることが示唆された。

【目的】光刺激に対する視交叉上核（SCN）は網膜からの直接の投射が存在する腹外側部（VLSCN）と投射のない背内側部（DMSCN）に分けられる。すでに我々は、この２つの領域の概日リズムが明暗サイクルのシフトによって脱同期すること、それが原因で時差症候群を引き起こしていることを明らかにしている（J. Neurosice. Nagano et al. 2003）。今回、VLSCNとDMSCNとの外部入力に対する応答の差異がどこに起因するのかを検討した。【方法】mPer2 promoterの制御下でluciferase遺伝子を発現するラットSCNの組織スライス培養を作製し、発光を経時的にモニターすることによって、概日リズムを捉えた。組織スライス培養にadenylate cyclaseを賦活化するforskolinを作用させ、概日リズムの変化を微量光測定装置およびCCDカメラを用いて検討した。一方でラット VLSCNとDMSCNの組織を個別にパンチアウトしたのちRNAを採取し、DNAマイクロアレイによって発現解析を行った。得られた結果から領域特異的に発現する受容体

視交叉上核の腹外側と背内側部に特異的に発現する受容体を探索するためDNA マイクロアレイを用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果VIP（血管作動性ペプチド）の受容体の一つであるVipr2が背内側部に特異的に発現することが明らかになった。これは、in situ hybridizationによっても確認された。そこで、視交叉上核のスライス培養を用いて、VIPを投与した。その結果、位相変位が生じることが確認できた。

視交叉上核からの位相情報を伝える制御因子には様々なものが報告され ているが、主要な因子の１つとして副腎から分泌されるグルココルチコイドがあ る。我々はグルココルチコイドが末梢臓器の時計機構に与える影響を調べるため に、以下の実験を行った。 副腎を除去(ADX)したラットを作成し、対照群と共に一日を通して4時間おきに6 点でサンプリングを行った。肝臓、腎臓からmRNAを抽出し、定量的PCR法で時計 遺伝子rPer1, rPer2, rCry1, rBmal1のmRNA量の日内変動を測定した。その結 果、いずれの遺伝子とも位相に変化は見られなかったが、ADXラットのrPer1は肝 臓、腎臓ともに日内変動の振幅が大幅に減衰していた。rPer2, rCry1, rBmal1 は、肝臓では大きな変化が見られなかった。しかし、興味深いことに腎臓では日 内変動の振幅が大きく減衰していた。 次に、末梢時計の位相制御におけるグルココルチコイドの関与を調べた。内因性 のグルココルチコイドの影響を

視交叉上核(SCN)は網膜から直接の投射が終止する腹外側部(VL-SCN)と直接の投射のない背内側部(DM－SCN)の領域に明瞭に区分される。生物の体内時間に対して明暗周期を大きく変動させると、VL-SCNにおける時計遺伝子の発現リズムは新たな明暗周期に短時間で同調するのに対し、DM-SCNにおける同調には長時間を要するため、このことが時差症候群あるいは時差ぼけの原因になることを我々はこれまでに示してきた。しかしながらSCN内における領域的な同調様式の違いがどのように生じるかについてはまだ明らかになっていない。今回我々はmPer2::lucを発現するラットを用い、SCNの組織スライス培養を作成することで刺激に対するSCNの反応性を検索した。まず、cAMPのシグナル経路を賦活化するforskolinをSCNに作用させ、luciferineの概日発光リズムを微量光測定装置によって測定することで位相応答を調べたところ、forskolinへの刺激応答には明確な位相依存性が存在することが明らかになった。次に、mPer

時差ぼけの際に視交叉上核の腹外側部と背内側部が脱同期し、背内側部の位相の変位が遅延して、時差ぼけ症候を生じることが知られている。これらの時日から２つの振動体を視交叉上核に想定して、数理モデルを作成した。時差ぼけの修復、すなわち視交叉上核の再同期にかかる日数は後退に比較して、前進に日数をより要することが知られている。視交叉上核の遺伝子発現を忠実に再現しようと、非線形性を強める課程で、前進と後退の非対称性が表れた。

視交叉上核が日の長さを記憶し、それに伴って動物の行動に変化が生じることが知られている。視交叉上核にはMオシレーターとEオシレーターが存在し、その二つの振動子の位相差が調整されることによって、行動に変化が生じると考えられている。さて、視交叉上核は腹外側部と背内側部に別れる。我々は、背内側部が日長によって、その内側と外側部の位相差が拡大することを発見した。すなわちMオシレーターとEオシレーターがこの位相が乖離した２つの部分で構成されている可能性が高い。さらに、どうして、このような位相差が生まれるかについて、モデルを作成した。

視交叉上核が日の長さを記憶し、それに伴って動物の行動に変化が生じることが知られている。視交叉上核にはMオシレーターとEオシレーターが存在し、その二つの振動子の位相差が調整されることによって、行動に変化が生じると考えられている。さて、視交叉上核は腹外側部と背内側部に別れる。我々は、背内側部が日長によって、その内側と外側部の位相差が拡大することを発見した。すなわちMオシレーターとEオシレーターがこの位相が乖離した２つの部分で構成されている可能性が高い。さらに、どうして、このような位相差が生まれるかについて、モデルを作成した。

我々はグルココルチコイドの時刻情報伝達因子としての性質に注目し、 その血中濃度の日内リズムが臓器にリズム情報を伝えている可能性を検証した。 グルココルチコイドを産生する副腎を除去（ADX）したラットを作成し、肝臓、 腎臓での遺伝子発現を径時的に調べたところ、肝臓で時計遺伝子rPer1の発現の 減衰が認められた。一方、腎臓ではrPer1, rPer2, rCry1, rBmal1において、発 現リズムの振幅が大きく減衰していた。リズムの位相は肝臓、腎臓とも変化がな かった。ADXラット腹腔内へのコルチコステロン投与により、肝臓、腎臓での rPer1の発現が誘導された。しかし、rPer2の発現は誘導されなかった。この結果 から、rPer1発現リズムの減衰はグルココルチコイドの欠失によるものと考えら れたが、腎臓ではrPer2, rCry1, rBmal1の発現リズムも減衰していたことから、 rPer1の発現リズムがフィードバックループ全体の振幅の維持に関与している、 あるいはADXによって消

体内時計の中枢である視交叉上核に日長の変化がどのような影響を持つかを明らかにするために、時計遺伝子Per1遺伝子発現をin situ hybridizationを用いて検討した。その結果、背内側部の脳室近傍領域におけるPer1遺伝子の発現開始が早まり、それより外側の領域では、発現の終了が遅くなっていた。また長日の１日目では、腹外側部のPer1遺伝子の誘導時刻が早まったのに加え、背内側部の脳室近傍領域におけるPer1遺伝子の発現開始も早くなった。このことから、長日条件においては光条件の変化に伴い、背内側部のPer1発現が修飾され、発現ピーク時刻のずれおよび発現の延長をもたらしていることが示唆された。

生物時計の分子機構を明らかにするために、概日時計の位相に依存してリン酸化、脱リン酸化されるタンパクに注目しプロテオーム解析を行った。リン酸化の変動をうかがわせるいくつかのタンパクのうち、Elongation factor2 (EF2)について検討し、リン酸化の概日リズムを明らかにした。

生理活性脂質であるPGJ2は、抗炎症・抗腫瘍作用を有し、PPARγなどの核内受容体のリガンドとして作用することや、蛋白質中のC残基と共有結合して標的蛋白質の機能を制御すること等が報告されている。我々はPGJ2がラット・グリオーマ細胞株C6において概日リズムをシフトすることを発見した。PGJ2による位相変位は、デキサメタゾン刺激による同調後25hに添加したときに約10hの前進、48hの添加で約10hの後退を示した。対照的に36h後では位相変位はなかった。また、周期への影響はみられなかった。PGJ2による位相反応曲線(PRC)を作製したところ、C6におけるフォルスコリン添加時のPRCと位相が約180度ずれていた。PGJ2添加後の時計遺伝子の発現を経時的に調べた結果、一部の時計遺伝子の発現が添加後2hで抑制されていることを確認した。このことはPGJ2による位相変位は時計遺伝子の一過的な発現量減少によって生じることを示唆した。さらにPGJ2の2種類の代謝産物Δ12-PGJ2と15d-PGJ2をそれぞれ添

Kallmann症候群は、嗅覚の異常と中枢性性腺機能低下症を合併する病態である。プロキネチシン受容体タイプ２（PKR2） KO マウスは嗅球の形成不全と、中枢性の性腺機能低下症を示した。これは主要２症候を合併する初めてのKallmann症候群モデル動物であり、Kallmann症候群に対して、モデル動物を用いて原因を探索し、治療法を探ることが可能となった。原因であるが、嗅球の形成については嗅球を構成するニューロンの遊走障害が,性腺機能低下症はGnRHニューロンの遊走障害が原因であると考えられた。

脳中枢神経系のネットワーク解析や非侵襲的画像診断法の確立の第一歩 として、CTやMRIに用いられるソフトウエアと抗体による免疫染色法等を組み合 わせて、特定のタンパク質を発現する神経ネットワークを三次元イメージングで 可視化することに成功した。

我々は、体内時計の位相の指標として視交叉上核におけるPer1、Per２遺伝子の発現量を解析することで体内時計の示す位相を知ることができることを見出した。そこで、本シンポジウムでは、光が体内時計中枢の視交叉上核に及ぼす影響について、急激な明暗周期のシフトにより生じる時差症候群の分子機序、夜間の一回の光照射によって視交叉上核に一週間以上の影響を及ぼすこと、明期を延長することによって、視交叉上核の腹外側部と背内側部の非同期があらわれてくることなど、最近我々の教室で得た知見を空間軸および時間軸で解説した。

シンポジウム 「生理機能を支配する末梢の時計：生物リズム研究の新展開」にての発表。哺乳類の体内時計は中枢である視床下部視交叉上核がマスタークロックとして末梢の時計を制御する階層的システムをなしている。このような末梢時計のコントロールがどのような機序で生じているのかについて、検討を加えた。視交叉上核を破壊したマウスに対して、胎児の視交叉上核を移植し、末梢時計の運行が開腹するかと行った検討、および、副腎から分泌される液性因子（ホルモン）によって、肝、腎の時計が制御されているのかどうかについての検討について発表した。

プロスタグランジン類(PGs)はアラキドン酸カスケードを経由して生合成される生理活性脂質である。それらの中でプロスタグランジンD₂(PGD₂)は哺乳類の脳で内在性の睡眠誘導物質として知られている。PGD₂はさらに非酵素的に脱水化されプロスタグランジンJ₂（PGJ₂）を生じる。我々はマウスper2プロモーターの制御下にルシフェラーゼを発現するラット・グリオーマ細胞株C6を用い、発光をモニターすることでリアルタイムで概日リズムを測定できる系を用い、概日リズムに影響を与えるPGsを含む生理活性物質のスクリーニングを行った。その方法としては、まずデキサメタゾン（dex）によりC6細胞におけるper2転写を誘導し、その24～48時間後にPGsを培養液中に添加し、以降のリズムを計測することで変化を誘導する物質を選抜した。この結果、私たちはPGJ₂が位相依存的に概日リズムをシフトすることを発見した。PGJ₂による刺激は位相の

概日時計中枢である脳の視交叉上核では、これまで神経がリズム形成に主要な役割を果たしていると考えられてきた。しかし、視交叉上核のグリア細胞を培養して概日リズムを計測すると、他の細胞と比較して長期間概日リズムが継続することが分かった。そこで、視交叉上核由来のグリア細胞と、それ以外の大脳から採取したグリアの細胞株をそれぞれ複数樹立し、リズムを計測したところ、視交叉上核由来のグリア細胞株ではリズムがより長期間継続することが明らかになった。これは、視交叉上核のグリア細胞は、概日リズムの継続性、即ち細胞間のリズム同調機構に関与しているということが示唆される結果であった。そこで、我々は、視交叉上核とそれ以外の大脳由来の複数の細胞株の遺伝子発現プロファイルを比較する目的で、Microarray解析を行った。その結果、視交叉上核由来の３つの細胞株全てで、有意に発現の高い遺伝子群が同定された。その中には、これまで行動その

C6細胞をDexで刺激後、蛍光標識2次元ディファレンスゲル電気泳動解析（2D-DIGE）を行い、タンパクの振動を検討した。日内変動を示すと思われるタンパクを約20個検出し、MALDI-TOF/MS法にてタンパクの特定を試みた。これらの中には転写の振動を示さないものもあった。またスポットが酸性側にいくつもシフトし、リン酸化の変動を思わせるものもあった。

組織あるいは細胞特異的な振動遺伝子を明らかにすることを目的として、Gene tips を用いて、C6 グリオーマ細胞における振動遺伝子の検出を行った。代表的な時計遺伝子に加えて200をこす遺伝子にリズミックな発現を認めた。それらの一つにTgf-αがある。株化線維芽細胞ではTgf-αの発現にリズムは認められず、C6 グリオーマ細胞特異的であることがわかった。Tgf-αは光によるリズムのマスキング効果に関係すると考えられており、その分子機構解明にC6 グリオーマ細胞は有効である。（英文）

体内時計の中枢である視交叉上核において、Per1, Per2遺伝子発現の日周変動における日長時間の影響をin situ hybridization法を用いて検討した。その結果、長日明暗サイクル（明期１６時間、暗期８時間）で飼育したラット視交叉上核において、Per1, Per2遺伝子発現周期に網膜からの直接入力がある腹外側部領域と投射のない背内側部領域との脱同調が認められた。これらのことから、日長時間の変化は、網膜からの直接入力がない背内側部領域においても影響を及ぼすことが明らかとなった。（英文）

光環境の違いによって生じる体内時計中枢視交叉上核の多様性について述べた。（英文）

光による体内時計リセッティングの機序、および細胞系を用いて体内時計に作用を及ぼす薬剤の探索について話した。

夜間に光を動物に当てるとメラトニンの分泌が抑制されると同時に、体内時計中枢である視交叉上核に時計遺伝子Per1, Per2が誘導される。夜間の一回の光照射でもその影響が一週間以上にわたって残ることを、メラトニンの分泌量、視交叉上核における時計遺伝子の誘導をマーカーとして示した。

Prokineticin(PK1/PK2)は分泌性のタンパク質で、Gタンパク質共役受容体(GPCR)であるProkineticin 受容体(PKR1/PKR2)を介して、様々な生理的機能に関与する。PKR1とPKR2の生体内での働きを検討するため、PKR1とPKR2遺伝子欠損マウスを作成し、形態学的解析を行った。その結果、PKR2遺伝子欠損マウスのみに、明らかな形態異常、すなわち、嗅球および、生殖器の形成不全が生じていた。さらに生殖器の形成不全の原因について、検討を加え、中枢性の性腺機能不全であることが明らかとなった。また、胎児のnasal regionを検索すると、鋤鼻神経が前脳にいたらず途絶していることが判明し、GnRHニューロンの前脳への遊走の障害が、生殖腺の形成不全の原因と考えられた。

発光顕微鏡は、従来の顕微鏡システムの機能を生かしながら発光検出に適した 光学系を用いることで、発光をイメージングとしてリアルタイムに検出し、細胞 を長期的に生きたまま観察することを可能とする装置である。ルシフェラーゼ遺 伝子をレポーターとして転写調節機能を調べるルシフェラーゼアッセイは、S/N 比が良く定量性が高いため、遺伝子発現計測において広く用いられているが、従 来法であるルミノメーターでの検出では、細胞群全体の発光量計測しか行うこと

体内時計中枢である視交叉上核に発現し、行動を抑制する作用があるとされるProkineticin2(PKR2)とその中枢神経系での受容体であるPK受容体２（PKR2）の視交叉上核における分布について報告した。PK2が背内側部、腹外側に発現するのに対して、PKR2は背内側部に発現していた。背外側部は、発現が概日振動を示す時計遺伝子Per1が遅れて発現することから、視交叉上核内部における位相差にPK2ーPKR2の相互作用が何らかの役割を持つことを示唆する。さらに、PKR2遺伝子KO mouseでは、活動のリズムは残るものの変動が小さいこと、総活動量が減ること、夜の終わりに活動が上昇することなどを報告した。

主観的夜の一回の光照射の位相変位に対する影響を検討した。そして、恒常暗条件においては光照射によって、腹外側部が振動体として働くようになり、その位相情報が数日間にわたって背内側部に伝達され最終的に位相変位が達成されることが示唆される結果を得た。

C6細胞をDexで刺激後、蛍光標識2次元ディファレンスゲル電気泳動解析（2D-DIGE）を行い、核内タンパクの振動を検討した。日内変動を示すタンパクについてMALDI-TOF/MS法で質量解析を行い、タンパクの特定を試みた。振動を示すタンパクのうちPDIA3 (ERp57) 発現に注目し、解析を行った。PDIA3は刺激後16時間,34時間で高く22時間、28時間で低い振動を示した。一方転写レベルのリズムは見られず、PDIA3の振動は転写に依存しない振動であることが明らかになった。

発光顕微鏡システムを開発し、Per2::lucノックイン・マウスの視交叉上核スラ イスで、１細胞毎の発光リズムを測定に成功した。各細胞のリズム位相のずれも 観察され、細胞のデータとも併せてこのシステムの有用性が確認された。

体内時計中枢である視交叉上核に発現し、行動を抑制する作用があるとされるProkineticin2(PKR2)とその中枢神経系での受容体であるPK受容体２（PKR2）の視交叉上核における分布を検討した。PK2が背内側部、腹外側に発現するのに対して、PKR2は背内側部に発現していた。背外側部は、発現が概日振動を示す時計遺伝子Per1が遅れて発現することから、視交叉上核内部における位相差にPK2ーPKR2の相互作用が何らかの役割を持つことを示唆する。

Luc-assayやreal time PCRを用いて、C6 グリオーマ細胞がDEX刺激後安定したサーカディアンリズムを作ることを見いだした。さらに核内タンパクの振動を検出すべく、C6細胞をDexで刺激後、蛍光標識2次元ディファレンスゲル電気泳動解析（2D-DIGE）を行った。

視交叉上核（SCN)は哺乳類の概日時計の中枢である。SCNの破壊によって概日リ ズムが失われたマウスに他のマウスのSCNを移植すると、ホストマウスと移植さ れたSCNとの神経連絡が不完全であるにもかかわらず概日活動リズムが回復す る。われわれは移植されたSCNがホストマウスの末梢組織にどのような影響を与 えるのかを調べた。その結果、移植SCNはホストの末梢組織に概日リズムを発生 させることが明らかとなった。ホストマウスの末梢組織の時計遺伝子発現はイン タクトマウスと同様に日周変動していた。しかし、Period1, Period2では振幅が 大きく減少していた。これらのことから、移植されたSCNからの時刻情報は末梢 組織の時計機構を制御するが、時計遺伝子によって異なる制御を受けていること が示唆された。(英文）

視交叉上核における神経とグリアの概日リズム形成への関与について、樹立したグリア細胞株や視交叉上核の培養スライスの共培養等で検討した結果、グリア細胞が概日リズムに積極的に影響を与えているという知見が得られ、神経のみで説明されていた概日時計機構に新たなモデルを提唱することとなった。

T-cycleを用いて、前進、あるいは後退を必要とする明暗条件を作り、Per1, Per2遺伝子の光同調での使い分けについて検討した。そして、主観的夜の終わりにPer1にのみ依存した、主観的夜の始まりにPer2にのみに依存した位相変位が生じる概日時計の位相があり、その位相ではPer1が前進に、Per2が後退といった使い分けが生じていることを示唆する結果を得た。

視交叉上核（SCN）移植動物における、末梢組織の概日振動の有無とその位相を調べるために、SCN移植マウスの肝臓、腎臓、骨格筋をサンプリングし、時計遺伝子のmRNA量をリアルタイムPCR法で測定した。時計遺伝子は各臓器とも、対照群と同位相の概日リズムを示したことから、移植されたSCNは行動リズムだけでなく、末梢組織の概日振動を制御することが明らかとなった。

C6細胞におけるPer1/Per2の発現機構をTPA、horse serum、Dexamethasone (DEX), Forskolin (FK)を投与して検討した。すべての刺激がPer1を誘導したが、Per2誘導はHSのみにみられた。阻害剤を用いた結果からFKはCREBリン酸化を介して、TPAはERKリン酸化を介してPer1を誘導することが示唆された。DEXはERKリン酸化を示すものの、Per1誘導はGlucocorticoid 受容体を介してなされるようである。

PK2 の視交叉上核（SCN）における役割を明らかにするためPK2と、PK2の受容体であるprokineticin receptor 2 (PKR2)のラットSCNでの局在を調べた。rPK2 mRNAは主観的昼にピークを持つ日周変動を示した。一方、rPKR2 mRNAは日周変動を示さず、SCNの背外側の小領域にのみ、陽性細胞が密に存在していた。これらの所見はSCNでPK2による神経伝達があることを示唆する。

Per2遺伝子誘導メカニズムついて、血清刺激を用いて検討した。血清によるPer2遺伝子誘導はGq/11 coupled receptor, 細胞内Caを介して行われることが明らかになった。またGq/11を介した細胞内Ca誘導を誘因として細胞外Caの流入が生じこの流入もPer2のmRNAの上昇に関与することが明らかになった。

グリオーマ細胞では薬剤刺激によってサーカディアンリズムを誘導することができ、その誘導メカニズムはRat1細胞とは異なる可能性があることが示唆された。

体内時計を制御する重要な時計遺伝子であるmPer1とmPer2の視交叉上核における発現をそれらのイントロンの部分をコードしたプローブを用いて検討した。

マウスやラットの体内時計中枢である視交叉上核において、12時間明期: 12時間暗期の条件下では、Per1、Per2遺伝子の発現が明期と暗期の開始の前後に異なる様式で誘導されており、両遺伝子が内因性のリズムを24時間に同調させる機能を果たしている可能性を強く示唆した。

視交叉上核（SCN）の腹外側部（VLSCN）において、背内側部（DMSCN）と同様に明暗（LD）、恒暗（DD）条件下においてもPer 1の日周変動が認められるが、DD条件下ではその振動はLD条件と比較してかなり減弱する。そこで、in situ hybridizationを用いて同様の領域が存在するかを検討した。特にVLSCNの最も腹側に、１日を通してほとんど陽性細胞のない小領域を認めた。このことから、VLSCNにおいて自律性リズムを持つ細胞群と自身では振動せず、光刺激によりPer 遺伝子が誘導される細胞群が存在すると考えられる。

ラットSCNにおけるrPK2 mRNAの発現リズムとその局在について、Digoxigenin-labeledプローブを用いたin situ hybridization調べた結果、rPK2 mRNA発現ニューロンはSCNにおいて広く散在していることがわかった。またSCNにおけるPK2の光応答について調べた。その結果、PK2は主観的夜の前半よりも主観的夜の後半で強い光応答をすることが確認できた。

プロキネチシン2(PK2)の転写開始点上流0.7kbから0.3kbの領域はRat1やCOS7において転写抑制因子の結合が示唆された。さらに抑制領域を欠失させても明瞭な概日振動が見られないことから、視交叉上核おける概日振動はClock/Bmal1以外の組織特異的な振動形成因子による誘導が示唆された。

光同調メカニズムにおけるPer1、Per２の役割について検討するため、ラットにおいて、明暗周期を延長して、体内時計を後退させなければならない環境を作り、その際のPer1、Per２発現をin situ hybridization で観察した。その結果、２５時間の明暗サイクルで明期の終わりに、視交叉上核の腹外側部にPer２の強い発現を観察した。そして、Per1が位相前進にPer2が位相後退に働くことを示唆した。

体内時計の中枢である視交叉上核の背内側部は網膜からの投射が無く、環境の明暗変化にすぐには同期できず、時差ぼけの原因となっている。環境の明暗サイクルのシフトによって、網膜からの投射が存在する腹外側部と背内側部の脱同調が一時的に生じ、背内側部の環境への同期に時間がかかることが、時差ぼけを生じていることを発表した。

体内時計研究において、これまでに出会った心躍る発見について発表した。 ひとつめは、in situ hybridizationによって初の哺乳類時計遺伝子が、哺乳類体内時計の中枢として知られていた視交叉上核に強く発現することを明らかにしたこと。二つめは、時差ぼけの機序を明らかにしたこと。３つめは、バイオインフォマティックスの技術を用いて、体内時計の夜をつくるゲノム上の転写制御の仕組みを明らかにしたことである。

Prokineticin 2 (PK2)はSCNにおいて強い発現リズムを示し、哺乳類の行動活動を抑制することが知られている。そこで我々はDigoxigenin-labeledプローブを用いたin situ hybridizationにより、ラットSCNにおけるrPK2 mRNAの発現リズムとその局在について調べた。その結果、rPK2 mRNA発現ニューロンはSCNの背内側部、腹外側部のどちらの領域にも広く散在し、各領域において強い振動を示した。またrPK2 mRNA発現ニューロンは複数のペプチドのmRNAと共発現していることがわかった。

これまでの研究でRNAの安定性が概日リズムの制御に重要なことが明らかとなった。我々は遺伝子の転写をより正確にとらえるために、重要な時計遺伝子の一つであるmPer2のイントロンをコードしたプローブを用いたin situ hybridization法により、mRNA前駆物質の発現リズム及び光による誘導を検討した。その結果、イントロンの反応はmRNAプローブを用いた場合より先に発現のピークが見られることが明らかとなった。そのため、イントロンを用いたプローブは転写の制御を検討する上で非常に有効な方法であると考えられる

プロキネチシン2(PK2)の転写開始点上流にClock/Bmal1によって活性化されるE-box保存配列があり、さらに転写開始点上流0.7kbから0.3kbの領域は細胞種によって異なる活性を示したことからこれらのE-boxがPK2の概日振動形成に重要であること、0.7kbから0.3kbに組織特異的な発現制御領域がある可能性を示唆した。

体内時計の中枢は視交叉上核に存在する。そのうち背内側部は網膜からの投射が無く、急激な明暗変化にすぐには同期できないため時差ぼけの原因となっている。今回我々は、明暗周期の１０時間の前進が、視交叉上核の背内側部の分裂を生じ、前進して同期するもの、後退して同期するものが生じることを明らかにした。

急激な明暗周期の変位に伴い、視交叉上核光反応部、腹外側部に振動体が形成される。それによって位相情報を背内側部に伝えると考えられた。

体内時計が時を刻む仕組み、関連する疾患、治療法について述べた。特に、規則正しい生活のためにどのように光りを利用していくのかを伝えた。

概日リズムは約２４時間周期をもつ生理的リズムで、その制御にはbHLHを持つ転写因子が重要な役割を示していることが知られている。Id2は HLHに結合し、転写を抑制することが知られ、概日リズムの制御への関与を調べるためにその発現の局在を検討した。

哺乳類における体内時計の光同調時期を同定するため、視交叉上核におけるPer1 の発現を検討した。その結果、２４時間より長い周期をもつラットは早朝の光刺激、２４時間より短い周期をもつマウスは夕暮れの光刺激が同調機構に重要な関係があると考えられた。

cAMPの活性化によって時計遺伝子Per1の誘導が生じる。phosphodiesterase阻害剤を用い、cAMPレベルを高いままに維持したときの細胞内リズムは調べると、Per1 mRNAの減少がみられた。Per1 mRNA発現の減衰期にはphosphodiesteraseは関与しないように見えた。

フォルスコリンはcAMPを活性化し、ついでA kinase あるいはRap1の活性化をもたらす。フォルスコリンによるPer1の誘導について、A kinaseからCREBのリン酸化、そしてPer1プロモーター領域にあるCRE siteの活性化の経路に加えて、Rap1の活性化の関与について検討した

視交叉上核に急激な明暗サイクルのシフト後現れる二振動体について述べ、時差ボケに伴いに振動体の解離が生じることを述べた

SHRSPの自由行動および自発運動についてWKYと比較検討した。その結果、運動量はWKYより少なく、加齢により低下した。

SHRSPの自由行動リズムとパターンをWKYと比較した。その結果、概日周期に差が無かったが、運動量はSHRSP1の方で少なかった。

ほ乳類の体内時計の中枢である視交叉上核において発現する新しいクラスターの時計遺伝子をGene Chipを用いて採取した。また、時差ボケの発生の原因について、講演を行った。

ラット視交叉上核においてHSP遺伝子の時間依存的発現及び光照射による影響について検討した。その結果、視交叉上核においてHsp40 mRNAは、光刺激により発現が誘導され、網膜からの投射部位へのグルタミン酸の放出に対して細胞保護に働くことが示唆された。

マウスの視交叉上核から取り出したRNAを用いて体内時計の夜を形作る遺伝子群を解明し、in situ hybridizationを用いて中枢神経での局在を明らかにした。それを、ごく最近明らかになったヒトのゲノム配列と照らし合わせることによって、体内時計の夜の時間を作るのに重要な働きをする因子を世界で初めて明らかにした。

長期にわたって光入力を断つことにより視交叉上核腹外側部のper1の日周変動にどのような変化を生じるかを検討した。結果から視交叉上核腹外側部のper1の振動の振幅は、光入力に依存したものであることが考えられた。

熱ショックタンパク質の遺伝子がマウス、ラット視交叉上核においてサーカディアンリズムを示しているかを検討した。その結果、マウスにおいて、HSP40 、HSP105、HSPa5の遺伝子発現は主観的夜に高く、主観的昼に低いリズミカルな発現パターンを示すことが明らかとなった。

Rat1細胞へのフォルスコリン(FK)投与はrPer1の誘導をもたらす。FK投与時の刺激伝達は、cAMP産生、ついで、PKA依存的な、あるいは活性型Rap1を産生する経路へと伝達される。我々はFK投与時のrPer1 誘導における活性型Rap1の関与について検討した。

体内時計が２４時間の周期を作り出す仕組みと、日々生じるずれの調節に光照射が有効であることを解説した。

体内時計の中枢は視床下部の視交叉上核に存在する。 急激な明暗サイクルのシフト後に腹外側部に概日振動子が一時的に生じる事を報告した。また、腹外側部の時計が一時的に大きな振動を生じてその位相を背内側部に伝えるとのモデルを提出した。

aquaporin 4は脳にみられる代表的な水チャンネルタンパクである。このタンパクが培養アストログリア細胞膜に発現するためには、C末端での二つの重要な部分が関与している。一つは疎水性部分、もう一つはPDZ結合領域である

マイクロアレイ法により視交差上核と肝臓において概日リズムを示す遺伝子をin situ法を用いて周期的発現及び発現部位の特徴を検討した。

光条件の急激な変化に伴って（体内時計が存在する）視交叉上核に生ずる、一時的な同期状態からふたたび同期するまでの変遷について述べた。

時差ボケは哺乳類の体内時計が存在する視交叉上核の背内側領域が環境の変化に取り残されることから生ずると考えられる。

科学的思考法の養成を２学年におけるチュートリアル教育の最も大きな目標としたい。

今回我々は明暗条件（12：12）で飼育した場合のラットの同調機構をrPer1の発現を示標として分子レベルで検討した。その結果、ラットは早朝と夕暮れの光刺激によって体内時計を環境のリズムに同調すると考えられる。

時計遺伝子の一つであるCry1が体内時計の位相変位の際どのような反応形式で位相変位を生じるのかについて検討した。

眼球欠損のラット（LOU/CN/Krm)を用い、視交叉上核における形態的変化について検討した。その結果、網膜からの投射が存在しないために各種のペプチド産生ニューロンの遊走に異常が生じた可能性があると考えられた。

ラットにおける体内時計の光による同調時期を同定するため、明暗条件下と恒暗条件下での視交叉上核におけるrPer1 の発現を検討した。その結果、ラットは早朝の光刺激が同調機構に重要な関係があると考えられた。

体内時計におけるCry1 の役割を明らかにすることを目的として、 馬血清処理後のrCry1発現の誘導について検討した。Cry1発現のピークは処理後4～8時間で、Per2のピークに約4時間遅れることが解った。

体内時計の存在する視交叉上核は約10000ほどの自律リズムを持つ細胞によって成り立ち、それらの細胞は通常は同期し、サーカデイアンリズムをなしていると考えられる。時計遺伝子の発現を指標として、視交叉上核内の細胞の同期、非同期の状態を観察した。

時差ボケの際の視交叉上核における時計遺伝子発現を検討し、時差ボケに機序について、解説した。

元来、発生の途中に脳室から遊走する神経細胞は、視交叉上核を形成するが、眼球欠損の場合、網膜からの直接投射に関係しないためVIP. GRPの細胞局在に変化を生じたものと思われる。

ラットの明暗サイクルを急激にずらすと、視交叉上核に２つの相異の異なる時計が生ずることが、明らかとなった。そしてこの２つの時計が再同調するのに5～7日かかることが、時差ボケの原因になると考える。

時差ボケの機序を検討するために急激に明暗サイクルをずらし、ラット視交叉上核におけるPer1mRNAの変化を観察した。その結果、明暗サイクルのシフト後、視交叉上核に位相の異なる２つの時計を生じ、それが再同調するのに５~7日かかることが判明した。

アクアポリン4(AQP4)の細胞膜局在機構を明らかにするため、種々の長さのAQP4変異体を作成し、蛍光顕微鏡下であるいは免疫細胞化学的に局在を検討した。AQP4の全アミノ酸301のうち、C末26アミノ酸を欠損させると、膜に局在しなかった

哺乳類の体内時計の中枢である視交叉上核における体内時計の乖離とその再同調の機構、及び、その現象と時差ボケ、時差症候群の関連に関して述べた。

体内時計の光同調、視交叉上核の存在する体内時計の内的脱同調によって時差ボケの生じる仕組みについて述べた。

様々なアクアポリン4のＣ末変異体とGFPの融合タンパクを作製し、培養アストロサイトに発現させた。その結果、PDZドメインに結合すると考えられていたC末の配列はアクアポリン4の細胞膜への移行には関与しないことが分かった。

Per遺伝子を中心とした哺乳類におけるサーカディアンリズムの形成機構と、光同調、時差ボケの機序について述べた。

アクアポリン4(AQP4)の膜局在化機構についてAQP4-GFP融合タンパクを培養細胞に発現させ、その局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。様々な欠損変異体を作製し調べたところAQP4のC末部分に膜局在に重要だと思われる配列を見つけた。

サーカディアンリズムが失われたショウジョウバエのピリオド遺伝子欠失体Per0に、マウスPer1遺伝子をショウジョウバエtim遺伝子のプロモーターを用いて導入した。その結果、一部の系統で、サーカディアンリズムの回復を認めた。

Vipr2 KOラットとPer2-dLucレポーターをもつトランスジェニックラット（Per2-dLuc TG）の交配により、体内時計の状態を発光で追跡できる動物を得た。Vipr2 KO / Per2-dLuc TGラットから肺を摘出して器官培養したところ、Vipr2 KOラットでは肺のリズムが前進することを観察した。私たちは、Vipr2欠損ラットではコルチコステロンリズムが失われていることを確認しており、このことが肺の体内時計の異常の原因であるだろうと考えられた。事実、デキサメタゾンを投与した場合に、KOラットと野生型ラットの肺組織の概日リズムがほぼ類似した概日リズムを振動するように回復したことを観察している。 また、視交叉上核を切り出して培養下の発光リズムを追跡したところ、KOでも初期には明瞭な概日リズムが観察されるもののすぐに減弱してしまうことが分かった。これはVipr2 KOマウスでみられる現象と類似しており、サンプル調製時の人工的な刺激による概日リズムの惹起によるものであると考えられた。興味深いことに、CCDカメラによる観察では、KOラットでは視交叉上核の領域間にリズムの特性の違いが観察された。長期に観察を進めた場合に、領域間の位相が徐々に乖離し、結果として細かい領域では概日振動を保っているにも関わらず、全体では振動を失っている様子が観察された。現在、領域間にみられた違いを明確にするために、詳細な解析を進めている。

自然界では遭遇しない夜間の光暴露に対してどのような制御があり、中枢神経系がどのような反応を示すか検討を行った。今回、網膜から哺乳類体内時計中枢である視交叉上核（SCN）へ到り、さらにSCNからの投射領域にいたるまで位相依存性に光照射のシグナル伝達が制御されていることが明らかになった。まず、光照射によるSCNのコア領域における神経細胞の興奮が概日リズムによって制御されていることが明らかとなった。さらにこのようなゲートの仕組みが室傍核に及ぶことも明らかになった。さらに、直接光照射を受ける網膜においても位相依存性のゲート機構が存在することを証明した。

網膜において、光暴露によってもcFosの誘導が生じない、光入力がゲートされた位相の存在を確認した。さらに網膜神経節細胞のうちメラノプシンを含有する神経細胞（視交叉上核に投射する。）のみを観察し、cFosの発現に位相依存性があることが明らかになった。これは視交叉上核への光情報が網膜レベルで制御されていることを示唆する。また、マウスの明暗の日周変動をシフトさせ時差ぼけ状態を作り出し、ゲーティング位相のシフト様式を明らかにした。ゲートの位相シフト速度は視交叉上核背内側部（DMSCN）の概日リズムの位相シフトとよく一致した。この発見は、DMSCNがゲートの位相を決定することを示唆している。

視交叉上核発振細胞間の同期機構と位相波現象の機序の解明を目指した。視交叉上核の腹側部と背側部にて包括的遺伝子発現解析を行った。その結果、腹側ではVip遺伝子が背内側部ではVpac2遺伝子が最も特異性が高く、またおのおのの局在を形態学的に確認した。これはVIP/VPAC2受容体の視交叉上核内部における同期維持に対する重要性が示唆する。一方でラット視交叉上核のスライス培養を用いForskolinを加えて細胞間同期を破壊することができた。それによって異なる固有周期を持つ２領域を視交叉上核背内側部でつきとめることができた。さらに数値的シミュレーションにてこの領域周期差が位相波を作ることが示唆された。

我々記述のようにシアル酸転移酵素ST8SiaVI 遺伝子の発現が視交叉上核SCN,海馬HC に特異的かつ限局的に発現しており糖鎖関連遺伝子のST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは明暗条件(ZT)で飼育したマウスで、遺伝子発現に周期性があることを発見した。さらに、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8SiaVI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを明らかにした。

体内時計中枢である視交叉上核における細胞間同期機構を検討した。その結果、背内側部および腹外側側部という機能が異なる2つの領域を同期しているのがVIPとVpac2受容体を用いた細胞間の情報伝達であることが示唆された。また、視交叉上核が周期の異なる2領域に分割できることが明らかになった。これを数値的にシミュレーションしたところ、視交叉上核に見られる位相波現象を再現することができた。

視交叉上核(SCN)におけるシグナル伝達経路を明らかにするために、SCNにおけるペプチド産生細胞とその受容体を持つ細胞の局在を調べた。視交叉上核の腹外側部(VLSCN)にはVIP細胞が、背内側部(DMSCN)にはVIPの受容体であるVPAC2細胞の局在を認めた。また、DMSCNとVLSCNに分離したスライス培養に、VIPを投与するとDMSCNのみ位相に大きなシフトを認めた。以上の結果からVLSCNからDMSCNにVIPがVPAC2受容体を介して位相情報の伝達を行っていることが示唆された。

研究成果の概要:生物時計の組織特異的概日リズム発振機構の分子機構を明らかにするため、C6細胞を末梢時計モデルとして用い、組織特異的概日振動遺伝子および振動タンパクを検出した。Gene chipsにより約300の特異的振動遺伝子を、2D-DIGEにより数十個の振動タンパクを認めた。転写の振動を伴わない、タンパクリン酸化による概日振動を示すものもあった。タンパクリン酸化は細胞機能に関与し、その概日リズムを知ることは、細胞のリズム発振機構解明に意義深い

哺乳類では、主観的夜の光照射によって、視交叉上核の腹外側部(コア)にPer1、Per2が誘導され、位相変位が生じることから、これらの時計遺伝子が光同調などに関与すると考えられている。そこで、ラットを用いて体内時計の光による同調機能についてin situ hybridization法を用いて検討した。その結果、ラットは明期と暗期の移行時期の光刺激が同調機構に重要な関係があり、主観的夜の終わりに特に、Per1に依存した、主観的夜の始まりにPer2に依存した位相変位が生じる概日時計の位相があることを明らかにした。また、長日明暗サイクル(明期16時間、暗期8時間)で飼育したラット視交叉上核において、Per1,Per2遺伝子発現周期に網膜からの直接入力がある腹外側部領域と投射のない背内側部領域との脱同調が認められた。これらのことから、日長時間の変化は、網膜からの直接入力がない背内側部領域においても影響を及ぼすことが明らかとなった。 次に、光照射を体内時計のある位相で行うと概日リズムが消失する仕組みについて、細胞およびラットを用いて検討した。そして、全体としての概日リズムの消失が個々の細胞時計の脱同期によることを明らかにした。 次にProkineticin2(PK2)の視交叉上核における役割を明らかにするため、PK2とProkineticin receptor2(PKR2)のラット視交叉上核での局在を調べた。PK2は、視交叉上核に特異的に発現し、強い日周変動を示す。一方、PKR2は、背内側部の小領域にのみ、陽性細胞が密に存在していた。さらに、PKR2ノックアウトマウスを用いてのPK2、PKR2システムの機能解析の結果、PKR2ノックアウトマウスにおいて、嗅球の形成不全、性腺機能不全が認められた。これは、kallmann症候群の主要二症候を合併する初めてのマウスであることが判明した。

1.機能未知GPCRのクローニングおよびその機能についての検索。機能未知GPCR、GPRg1をクローニングした。特異的に中枢神経系に発現しており、尾状核被殻、手綱核、乳頭体などで強い発現を認めた。細胞への強制発現をおこない、Gq受容体特異的阻害剤を用いることによって、Gq/11にカップリングした受容体であることが明らかになった。(BBRC 2005) 2.Per1,Per2遺伝子が視交叉上核に誘導され、位相変位を生じる。Per1/Per2遺伝子が体内時計中枢である視交叉上核においてどのように使い分けられているのかを明らかにした。Per1依存性、Per2依存性の位相変位が生じるメカニズムが明らかになった(投稿中)。 3.Per2遺伝子誘導へいたる細胞内情報伝達経路を明らかにすることができた(Genes to Cells 2006)。Gqタンパク結合型受容体から、phospholipase C, IP3, IP3受容体、ERからの細胞内Ca2+放出、細胞外からの流入という一連の経路によって、Per2の誘導が引き起こされることが明らかになった。 4.グリオーマ細胞C6における概日リズムの発見した。グリオーマ細胞であるC6に顕著なサーカディアンリズムを認めた。(BBRC 2006)。 5.視交叉上核において振動する遺伝子として採取されたProkineticinとその中枢性の受容体であるProkineticin receptor 2(PKR2)の詳細な局在の検討。(European J.Neurosci.;2006) 6.PKR2ノックアウトマウスを用いた、PK2,PKR2システムの機能解析。PKR2ノックアウトマウスにおいては、嗅球の形成不全、性腺機能不全が生じた。Kallmann症候群の主要二症候を合併する初めてのマウスであった。(PNAS 2006)

以前我々がGeneChipで単離した発現が概日振動する遺伝子群の機能解析を迅速かつ多角的に遂行するために、以下の方法の開発・至適化とそれによる各遺伝子の機能解析を行ってきた。まず、各候補遺伝子を強制発現あるいは発現抑制するレンチウイルスベクターを作製し、産生した高力価のウイルスを用いてin vitroで機能解析を効率良く行う方法を確立した。次に、脳定位固定装置を用いて、体内時計の中枢である視交叉上核にレンチウイルスを注入し、遺伝子を強制発現(発現抑制)させた個体を作出することに成功した。これは従来の遺伝子導入マウスと異なり、ウイルスを感染させた個体をすぐに解析に使用できるので、複数の候補遺伝子の効率的な機能スクリーニングに適した方法である。我々は更に、脳のスライスに直接効率良くウイルスを感染させることにも成功した。これまで個体や組織に高率に遺伝子を導入することが困難だったことから、その手法の確立の意義は大きい。このような新たな手法の開発により、時計の中枢である視交叉上核での遺伝子操作が短時間で比較的容易に達成できるようになったので、我々は以下のように機能スクリーニングを進めてきた。第一に、視交叉上核で特定の遺伝子を強制発現(発現抑制)させたマウスを作製し、各個体の行動、体温等の概日リズムを測定する。恒暗、恒明条件、光パルスや明暗周期の変化が体内時計に及ぼす影響など細かい解析を行う。第二に、時計遺伝子Per2のプロモーターにluciferaseを連結したレポーターを導入したマウス・ラットから視交叉上核のスライスを作製し、そこにレンチウイルスを感染させて遺伝子を導入することにより、候補遺伝子の概日時計への機能的関与を解析する。更に、同じスライスでMEDシステムを用いた電気活動リズムの測定も可能である。以上の方法で、次々に候補遺伝子の機能スクリーニングを行っており、Rgs16とHmg4の概日時計における役割に関しての論文の発表準備中である。

我々は、Gene Chipでマウス視交叉上核において著明な振動を示した遺伝子について、in situ hybridizationを行い、実際、視交叉上核に明瞭なリズムを示す遺伝子を同定した。このうち、Id2、Dexras1、Hspa5遺伝子などの概日リズム制御機構への関与について検討を行った。その結果、Id2遺伝子がBmal1とClockによるPer1遺伝子の転写に対して抑制的に働くことを明らかにした。また、Id2ノックアウトマウスの行動解析により、Id2が位相の後退に関与する所見を得た。次に、Dexras1やHspa5遺伝子発現は、夜間に高く、主に視交叉上核の背内側部に認められた。そこで、これらの遺伝子は、概日周期の主観的夜における他の遺伝子の転写やタンパク発現などに関わり、概日リズムにおいて夜間の形成に関与する可能性が考えられた。 また、我々は、時差ボケにおいて環境の時計と体内時計がずれを生じる仕組みを明らかにした。すなわち、体内時計の中枢である視交叉上核に、光によって迅速に位相を変化させる領域と、すぐには同調できない領域が存在する。そして、急激な明暗サイクルのシフトに伴って、この2領域の脱同調がおこり、再同調するまでに時間を要することが時差ボケの原因であると提示した。これにより視交叉上核に2つの機能領域(二振動体)が存在することが明らかになった。また、ラットを用いて体内時計の光による同調の時期についてin situ hybridization法で解析した結果、網膜からの投射が存在する細胞群が明期の始めと終わりの光刺激により、時計遺伝子の発現が誘導されることを明らかにした。 現在、上記の遺伝子の光同調への関与について、これら遺伝子の光同調時期における視交叉上核の2つの機能領域での遺伝子及びタンパクの経時的発現、さらに時間依存的な反応の解析を進めている。

1.視交叉上核における体内時計乖離現象の発見と時差ボケの機序の解明。 急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の腹外側部と背内側部でPerl遺伝子が異なる時間帯に発現することを示した。明期の開始時間を急に10時問遅らすと、ラットでも本来活動すべき暗期に、昼と同様の運動量が低下した時間が数日間にわたって生じる。すなわち、時差ボケがラットに生じたと考えられる。ここで、行動リズムとSCNの時計遺伝子の発現リズムの相関関係を検討した。新たな光周期に移った1日目からVL領域は再同調できたのにもかかわらず、光入力のないDM領域では、ゆっくりと一週間ほどかけて時計遺伝子の発現リズムは新たな光周期に同調していった。また、明暗周期を6時間前進させると、同様のDMとVLの解離を認めた。すなわち、VLのみが先に環境の明暗周期に同調し、DMは10日から14日をかけて、再同調がもたらされた。このさい、DM領域の再同調と行動リズムの再同調のパターンに強い相関関係を認めた。これはDMとVLの脱同調が時差ぼけの原因であることを示唆するものである。現在、再同調を早めるための試みを行っている。 2.視交叉上核における網羅的遺伝子採取と体内時計の夜に発現する遣伝子群に共通する転写応答配列の発見マウスの視交叉上核から取り出したRNAを用いて体内時計の夜を形作る遺伝子群を解明し、それを、ごく最近明らかになってヒトのゲノム配列と照らし合わせることによって、体内時計の夜の時間を作るのに重要な働きをする因子を世界で初めて明らかにした。まず、Gene Chipを用い(今回は12000種のマウス遺伝子について検索を行った。)、視床下部において約一日を周期として発現が変動する約100種類の遺伝子をまず明らかにした。これらの遺伝子の中で体内時計の夜(主観的夜と称する。)に活発に遺伝子が発現するものを選び、ゲノム配列を参照することによって、遺伝子の発現調節領域に10から11塩基の共通の遺伝子配列を見いだした。この配列にはRev-erbと呼ばれる因子が結合する。サーカディアンリズムを作り出す株化細胞系を用いることによって、この遺伝子配列が体内時計を動かすのに必須の配列であることを証明した

1.視交叉上核における体内時計乖離現象の発見と時差ボケの機序の解明:我々は急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の腹外側部と背内側部でPer1遺伝子が異なる時間帯に発現することを示した。 明期の開始時間を急に10時間遅らすと、ラットでも本来活動すべき暗期に、昼と同様の運動量が低下した時間が数日間にわたって生じる。すなわち、時差ボケがラットに生じたと考えられる。ここで、行動リズムとSCNの時計遺伝子の発現リズムの相関関係を検討した。新たな光周期に移った1日目からVL領域は再同調できたのにもかかわらず、光入力のないDM領域では、ゆっくりと一週間ほどかけて時計遺伝子の発現リズムは新たな光周期に同調していった。また、DM領域の再同調と行動リズムの再同調のパターンに強い相関関係を認めた。これはDMとVLの脱同調が時差ぼけの原因であることを示唆するものである。 2.視交叉上核における網羅的遺伝子採取と体内時計の夜に発現する遺伝子群に共通する転写応答配列の発見:マウスの視交叉上核から取り出したRNAを用いて体内時計の夜を形作る遺伝子群を解明し、それを、ごく最近明らかになってヒトのゲノム配列と照らし合わせることによって、体内時計の夜の時間を作るのに重要な働きをする因子を世界で初めて明らかにした。 3.トランスジェニックショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析:ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。また、mPer1を導入した系統と、mPer2を導入した系統では、その周期に優位な差が存在した。これは、Period遺伝子が種を越えて、同様の機能を持つことを示唆する。 4.cAMP分解酵素の阻害によるPer1遺伝子発現増強の試み:主観的夜における光照射による位相変位の大きさがPer1の発現量に比例することを我々は以前に報告している。また、cAMPによって、Per1の発現が誘導されることも知られている。これに伴い、cAMPの分解を進めるphosphodiesterase阻害薬を用いてPer1の発現量を増加させることが可能かを検討した。

生体リズムの情報伝達系を分子のレベルで明らかにするため以下の研究を行った。(1)クリプトクローム(CRY)は光回復酵素を祖先型タンパクとするフラボタンパクファミリーの一員である。一次構造の類似性のみでなく、その高次構造も光回復酵素とよく似ていること。CRYは、CLOCK, BMAL, PERタンパクと相互作用することにより時計遺伝子の転写抑制を行っている。CRYは、CLOCK, BMALヘテロダィマーに直接結合するが、それによりヘテロダイマーのDNAへの結合が阻害される事はなく、安定なCRY/CLOCK/BMAL DNAの複合体が形成される。(2)時計遺伝子のコアフィードバックループから出力する新しいタイプの時計転写因子PAR/E4BP4系を発見した。(3)mPerlプロモーター・luciferase遺伝子導入トランスジェニックマウスを作成し、生体内での時計遺伝子発現のリアルタイムモニター系(Nature 2001)、生体外での薬剤の時計遺伝子のリアルタイムアッセイ系を確立した(Nature2001;Curr Biol,2001)。(4)rat-1線維芽細胞系を用いて、線維芽細胞にも視交叉上核と同様の時計のコアフィードバックループがあり、時を刻むことを証明した(Science,2001)。(5)時計の主要振動遺伝子であるPER2が、細胞質-核内をシャトルし、ユビキチン化して分解されることを発見した。(6)マウスmPer1,mPer2遺伝子をショウジョウバエ無リズム変異体Per0に導入し、行動リズムの回復を観察した。

生体時計の分子機構の総括班会議を行った。本年度は特定領域研究の最終年度に相当するので、それぞれの班の研究代表者による4年間の研究成果の発表を行い、それに対する質疑応答を行った。本間班ではフィードバックループの形成に重要であるDec1,Dec2遺伝子を同定し、これがPer遺伝子に対する転写抑制作用が強いことを明らかにし、その成果はNatureに掲載された。また、clock変異体マウスを用いた研究から、視交叉上核内細胞間のカップリングが発振に垂要であることを明らかにした。柴田班では毎日一定時刻に餌の提示を行うことにより、末梢時計がリセットされることを世界に先駆けて発表した。グルコースの一過性の上昇が必要である可能性については深田班の研究で明らかにされた。深田班は体内時計の発振、リセット機構にMAPキナーゼのリン酸化が関与していることを、ヒヨコの松果体やマウスの視交叉上核、さらに培養細胞系で明らかにしてきた。福永班では、時計のリセット機構にCaMKII,IVがかかわっていることを明らかにした。また、共同研究の滝口らのグルーブが肝臓でプラスミノーゲン遺伝子発現に独自のリズム機構が働いていることを明確にした。海老沢班ではヒトのサーカディアンリズム障害と時計遺伝子多型について調べた。Per3遺伝子の変異と、睡眠リズム位相後退や非24時間リズム障害との連鎖が報告された。また、Per2蛋白のリン酸化にかかわっているカゼインカイネース1イプシロンの変異と、睡眠リズム疾患との関連性も述べられた。近藤班ではシアノバクテリアを用いた時計の分子機構が精力的に進められ、特にkaiA,B,C遺伝子産物のリン酸化や、多量体形成機構についての研究が進んでいた。評価委員の井上、永井各氏は研究成果の内容等に高い評価を下した。また、班員間の共同研究も十分行われているという評価を得た。

視交叉上核におけるPer1遺伝子の誘導の限局性と時差ボケの機序の解明 夜間の光照射によってラットPer1は視交叉上核の腹外側部に発現し背内側部には誘導されなかった。Per1の誘導は位相変位のinitial stepと考えられており、このようにPer1遺伝子が限局した部位にのみ発現することは光反応性の時計と光には直接反応しない時計の2種類の体内時計が視交叉上核の中で乖離して存在することを示唆する。更に明瞭に2つの時計の存在を明らかにするため、急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の時計の位相をPer1の発現を指標として観察した。この際に背内側部の位相は明暗サイクルのシフト後にもとの位相からシフト後の位相に変位するのに約一週間を要しこれが時差ボケ現象の原因であると考えられた。 遺伝子導入ショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析 ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。 マウス時計遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析 Per1,Per2,Per3cDNAおよび、おのおのの遺伝子の上流の調節領域を採取し、そのプロモーター活性を測定した。これらのcDNAを発現ベクターに組み込み、エピトープタッグとしてFLAGを下流に結合し、株化細胞であるCOS7に発現させたところ、Western blottingにてタンパクの発現を検出できた。また、GFPにPer1,Per2,Per3を結合させて、その発現を観察した。これを用いてトランスジェニックマウスの作成段階に入っている。最近になり他施設よりPer1を過剰発現するトランスジェニックラットが作成された。今後、このようなラットに関しても時計遺伝子の発現の解析を行う予定である。また、TetracyclinによってPer1の発現が誘導される遺伝子導入動物の作成にも着手している。

先年度発見したmPer1に続き、ショウジョウバエperiodホモローグであるマウス時計遺伝子mPer2,mPer3を世界で初めてのクローニングした。mPer2は、mPer1と同じく、リズム中枢のある視交叉上核で昼は強く発現し、夜はほとんど発現しないが、そのピーク時間は約4時間ずれていた(Genes Cells,1998)。もちろん、恒常暗条件下でもこのリズミック名発現は検出された。続いて発見したmPer3の発現パターンは、明暗条件下でも、恒常暗条件下でも、昼に広くなだらかなピークのある発現を示し、夜でも発現量が減るが確実に発現し、mPer1,mPer2と異なるパターンであった(EMBOJ.,1998)。 視交叉上核の発生時期に発現する転写因子をDIFFERENTIAL mRNA DISPLAY法にて検索した。その結果、生後10日間のみ発現するDNA結合ドメインを持つ転写因子lot1を単離した。このmRNAの発現は恒常暗条件下でも、著明なサーカディアンリズムを示した。この転写因子は、視交叉上核以外の脳部位にも強く発現し、それら部位の発達に関与していることが示唆された。詳細な高感度の検出法では、発生終了後もこの遺伝子発現は続くが、その意義は不明である。ごく最近、mPer1とへテロダイマーを形成する哺乳類Timelessのクローニングにも成功した(Genes Ce11s,1999).このヘテロダイマー形成は核の中でのみ見つかっており、今後の検討が待たれる。

クローニングしたmPER3はmPERl,mPER2よりやや小さく、1115アミノ酸からなる蛋白質であった。ショウジョウバエdPerの特徴とされる、蛋白質相互の結合に関与するPASドメイン(PAS-A,PAS-Bからなる)は、mPER1,mPER2と同様よく保存されていた。また、ショウジョウバエ時計遺伝子dPerを細胞質にとどめ、核内移行を抑制するcytoplasmic localization domain(CLD)構造が保存されていることも、大きな特徴である。mPER3には他のmIPER1,mPER2に認められないnuclear localizationsignal(NLS)がある。視交叉上核においては、明暗条件下、恒常暗条件下でも24時間リズムを示す。そのリズムは、CT4-8にかけて高く、mPERl,mPER2と同様、 「昼時計」型であるが、nPERl,mPER2と異なり、夜にもかなり発現しており、昼夜での振幅は小さい。 我々は、哺乳類のmPERの発現にもtimeless遺伝子が重要かどうかを検索するため、mTIMのクローニングを行った。mTIMは1197アミノ酸からなる蛋白質で、dTIMと4つのドメインで相同性が高かったが、全く異なる配列が、挿入されていた。mTIMとdTIMの分子構造を比較すると、確かにmTIM分子はPERとの結合領域のうちPAS-Aと結合する部分は保存されているが、PAS-B/CLDと結合する部分には新たなアミノ酸の挿入があり、dTIM分子が細胞質内にいてPER/TIMの核移行を妨げる重要な性質であるdTIMのCLDはほとんどmTIMでは保存されていない。このことは、mTIMの3カ所のNLSに引きずられ、mTIMは通常の核蛋白として、核の中に直ぐ入ってしまい、TIMが哺乳類では核移行のregulation stepを司る役割を失っている事を示唆している。

我々がコネクシンの保存領域を用いたディジェネレイトプライマーを用いて採取したラットの新規コネクシンについて、Northcm hybridizationを行い各臓器での発現を観察すると中枢神経系で最も強い発現を認めた。この新規コネクシンはコネクシン26に高い相同性を持っていた。その後、この遺伝子はDahlらが新規にクローニングしたコネクシン(コネクシン30)と96%の相同性があることが明らかになり、我々が採取したのはラットの相同遺伝子であると考えられた。この、cDNA断片を用いてin situ hybridizationを行ったが視床下部での発現は多くはなかった。また、その他のコネクシンのmRNAの分布を、コネクシン26mRNA,コネクシン33mRNAに関しては、中枢神経系にて明らかな発現を認めなかった。その一方で、コネクシン32、および、コネクシン43mRNAに関しては神経系での広範な発現を認めた。これらのmRNAは中枢神経を傷害することによってその発現量が著明に増大することが明らかになり、神経系の修復過程に関与すると思われた。また、コネクシン32、コネクシン43は両者とも視床下部において発現し、なおかつ、in situ hybridizationによる分布より、コネクシン32はニューロンに、コネクシン43は、グリアに存在すると思われた。また、室傍核には、コネクシン32の発現を認めた。これらの結果を考慮して、コネクシンを過剰発現するトランスジェニックマウス作成のため、コネクシンcDNAを用いてconstructionを作成した。

脊椎動物における概日リズム(circadian rhythm)をつかさどる時計(circadian clock)の所在が明らかになったのは、鳥類の松果体である。これに対し、哺乳類松果体は、光受容能が全く失われており、メラトニン合成の日内リズムは完全に上頚神経節由来の交感神経系の支配を受けており、上頚神経節除去にてこのリズムは消失する。今回、ラット松果体の交感神経を切断し、2週間後の松果体を検索した。切断は、チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学をおこない、上頚神経節からのノルアドレナリン線維の投射が消失していることで、確認している。電子顕微鏡にても神経終末構造の消失を確認している。松果体でのNGF,b-FGF,GDNF発現を検索したが、発現の大幅な変動は認められなかった。次に、切断時期に変動する成長因子関連遺伝子や新規因子を見つけるため、PCR法を応用したdifferential mRNA dispalyにて検索した。このうち、成長因子や成長因子受容体及び、そのホモロジー遺伝子を検索する。現在、6種類の候補遺伝子を得て、クローニング中である。また、シュワン細胞の基底板管を用いた末梢神経の再生のモデルを用いてbFGFの効果を検索した。bFGFは神経軸索に直接に働き再生を促進することを確認した。

ショウジョウバエでは生体リズムを司る時計遺伝子periodが既にクローニングされ、その発振機構の解明が進んでいるが、平成8年の時点では、哺乳類では全く不明であった。平成9年度より、我々は、東京学医科学研究所の程・榊グループと哺乳動物の生物時計の構成分子の検索を始め、リズム発振に重要とされるショウジョウバエperiodのPASシークエンスに当たる部位でdegenerate primerを作製し、PCRスクリーニングをヒトゲノムライブラリーで行った結果、periodホモローグであるヒト時計遺伝子hPer1、マウス時計遺伝子mPer1を世界で初めてクローニングした。マウスにおいては、リズム中枢のある視交叉上核で昼は強く発現し、夜はほとんど発現せず、この性質は明暗条件下、恒常暗条件下ともに認められる性質であった(Nature1997)。さらに、この遺伝子の転写は、光刺激により急速に誘導されること、また、この遺伝子誘導が行動リズムの位相変動に極めて近似した現象であることを見出した(cell,1997)。続いて、同じくperiodホモローグのmPer2,mPer3という第二、第三の全くリズム特性が異なる遺伝子を発見した(Genes cells,1998;EMBO J.,1998)。ごく最近、mPer1とヘテロダイマーを形成する哺乳類Timelessのクローニングにも成功した(Genes Cells,1999)。

哺乳類の体内時計に関しては、1970年代に体内時計のマスタークロックが視床下部視交叉上核に局在するという発見以来、この核の機能解析を中心に研究が進んできたが、時計自身の物質的な根拠に乏しいため、その根本的なメカニズムに迫るには限界があった。この状況で我々は程とともにショウジョウバエ時計遺伝子Periodの哺乳類ホモローグをクローニングし、視交叉上核での時間特異的発現を報告した(Nature,1997)。我々はこの哺乳類時計遺伝子mPer1が、哺乳類における重要な時計遺伝子であることを数々の方法で検索中であるが、本重点研究においては、この時計遺伝子哺乳類mPer1の発現が、光による行動リズムの位相変位にどのように関与するかを検索した。フリーラン条件下で、mPer1 mRNAの視交叉上核での発現を検索すると、約23時間間隔の発現変動が数周期にわたり観察された。mPer1 mRNAは視交叉上核には主観的暗期には全く認められないが、主観的明期に入ると上昇し始め明期開始後4時間でピークに達する。その変動幅は5-10倍あり、4周期後も全く低下傾向は示さなかった。この事は、行動リズムと同様、視交叉上核でのmPer1の発振メカニズムは恒常暗条件にても安定であることを示している。また、主観的暗期に光パルスを与えると、視交叉上核でmPer1の遺伝子が誘導された。また、この発現は、光量のlog値に比例して上昇した。この変動量は光による行動の位相変位と全く相関していた。この事は、mPer1の発現程度と行動位相変位の程度が全く相関する事を示しており、mPer1発現が位相変位に関与していることをさらに想定させる。

明暗(LD)条件下明期にて、視交叉上核に特異的に発現し、他の脳部位で発現しない遺伝子をDifferential mRNA display法にて検索した。そのうちの一つY01は新しいcDNAであって、cDNA in situ hybridizationにて、視交叉上核に強いシグナルを発現していた。また同手法を用いて、新規に、時間特異的発現遺伝子、光誘発関連遺伝子も数個同定した。最近、我々は、脳内アミンによりペプチド性脳内伝達物資が変化し、行動変化を来すことを報告した。また、ペプチド作動性細胞が、新しいタイプの細胞間物質でリズム位相変位物質でもある一酸化窒素(NO)産生能を有し、また発現させることを明らかにした。従って、アミンやNOの枯渇時の視交叉上核における遺伝子の発現も、Differential mRNA display法にて検討中である。 また、成熟ラットにおいては、視交叉上核におけるVIPは、光刺激依存遺伝子として知られる。そこで、ラットVIP遺伝子の発生と遺伝子発現のリズム様式の変動の相関を検索した。VIP遺伝子は胎生末期に発現し、明瞭な昼高く夜低い内因性リズムは生後10日より認められた。このリズムは視交叉上核への入力線維が急増する生後20日以降、新しくVIP遺伝子を発現するニューロンの出現とともに、光従属性リズムへ変動した。これは、光刺激入力が新しい遺伝子のフェノタイプを誘導し、リズムを制御するという初めての報告である。このVIP遺伝子のリズム変移現象は、概日リズムの光周期への同調の形成機構の物質的探究の手がかりとして、現在探究中である。

新たな神経系特に視床下部に発現するコネクシンを検索するために、ラット視床下部より、mRNAを採取し逆転写酵素にてcDNAを作成した。即ち、J-A Heafligerらの方法に準じてコネクシン分子においてその塩基配列が、よく保存されている膜貫通領域にてdegenerate primerを作成した。PCRにてP32-CTPの存在下において増幅されたフラグメントをポリアクリルアミドゲルに泳動してそこに現れたDNAのbandを切り出した。8本の切り出されたバンドからPCRをおこなってDNAを回収し、プラスミドベクターにサブクローンして、おのおののバンドについて10個のクローンについて塩基配列を解析した。その結果、新規コネクシンのクローンを得た。そのクローンについて現在、in situ hybridization,Northern hybridizationを用いて、神経系での発現に関して検討を加えている。 また、現在までに発表されているコネクシンの塩基配列を元にしてprimerを作成し、いくつかのコネクシン分子に関してPCRを用いて部分的なcDNAを得た。それをプラスミドベクターにサブクローンして、in situ hybridizationを行った結果、コネクシン32mRNA、および、コネクシン43mRNAに関しては神経系で広範な発現を認めた。また、これらのmRNAは中枢神経を傷害することによってその発現量が著明に増大することが確認された。コネクシン26mRNA,コネクシン33mRNAに関しては、中枢神経系にて明らかな発現を認めなかった。