A definitive understanding of intrinsic functions of endogenous melatonin may require genetic manipulation or modification of its synthesizing enzymes. Here, we established Syrian hamsters, a seasonal mammal, carrying loss of function of aralkylamine N-acetyltransferase (AANAT), a rate-limiting enzyme in melatonin biosynthesis. Mutants showed a normal circadian period but an accelerated entrainment to rescheduled light-dark cycles. We next focused on the role of melatonin in autumn/winter anticipation, given the strict increase in levels during short days. On exposure to cold after habituation to short days, all controls maintained normal core body temperature (T b), whereas many mutants showed a decrease in T b. Food shortage after this cold exposure induced hibernation in all controls and mutants; however, all mutants failed to continue a normal hibernation cycle, probably due to impaired T b elevation during arousal from deep hibernation. These failures were accompanied by a decreased volume of lipid droplets in the interscapular brown adipose tissue (iBAT). Histological analyses of the pars tuberalis suggested a defect in photoperiodic responsiveness in mutants. Taken together, these findings demonstrate that defective photoperiodic responsiveness caused delayed remodeling of the iBAT in mutants and that sudden exposure to autumn/winter conditions caused severe defects in T b homeostasis and interbout arousal, in both of which iBAT-mediated nonshivering thermogenesis plays a major role. AANAT-mediated melatonin biosynthesis appears to be indispensable to the survival of wild seasonal mammals in natural settings.

Collagen I is the most abundant type of intramuscular collagen. Lysyl oxidase promotes collagen cross-link formation, which helps stabilize the extracellular matrix. Furthermore, matrix metalloproteinases, responsible for collagen degradation, maintain typical muscle structure and function through remodeling. Although it is well known that aging leads to delayed recovery of muscle fibers, the impact of aging on the remodeling of intramuscular collagen is not well understood. In this study, we investigated the impact of aging on collagen remodeling during muscle injury recovery using young and old mouse models. Muscle injury was induced in the right tibialis anterior (TA) muscle of male C57BL/6J mice [aged 21 weeks (young) and 92 weeks (old)] using intramuscular cardiotoxin injection, with the left TA serving as a sham with saline injection. Following a one-week recovery period, aging was found to delay the recovery of the fiber cross-sectional area. The intensity and area of immunoreactivity for collagen I were significantly increased in old mice compared to young mice post-injury. Additionally, Lox expression and the number of LOX (+) cells in the extracellular matrix significantly increased in old mice compared to young mice post-injury. Furthermore, Mmp9 and MMP9 expression levels after muscle injury were higher in old mice than in young mice. These results suggest that muscle injury in old mice can lead to increased collagen I accumulation, enhanced collagen cross-link formation, and elevated MMP9 expression compared to young mice.

Cerebellar ataxia, neuropathy, and vestibular areflexia syndrome (CANVAS) has recently been attributed to biallelic repeat expansions in RFC1. More recently, the disease entity has expanded to atypical phenotypes, including chronic neuropathy without cerebellar ataxia or vestibular areflexia. Very recently, RFC1 expansions were found in patients with Sjögren syndrome who had neuropathy that did not respond to immunotherapy. In this study RFC1 was examined in 240 patients with acute or chronic neuropathies, including 105 with Guillain-Barré syndrome or Miller Fisher syndrome, 76 with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, and 59 with other types of chronic neuropathy. Biallelic RFC1 mutations were found in three patients with immune-mediated neuropathies, including Guillain-Barré syndrome, idiopathic sensory ataxic neuropathy, or anti-myelin-associated glycoprotein (MAG) neuropathy, who responded to immunotherapies. In addition, a patient with chronic sensory autonomic neuropathy had biallelic mutations, and subclinical changes in Schwann cells on nerve biopsy. In summary, we found CANVAS-related RFC1 mutations in patients with treatable immune-mediated neuropathy or demyelinating neuropathy.

Obesity and aging are known to affect the skeletal muscles. Obesity in old age may result in a poor basement membrane (BM) construction response, which serves to protect the skeletal muscle, thus making the skeletal muscle more vulnerable. In this study, older and young male C57BL/6J mice were divided into two groups, each fed a high-fat or regular diet for eight weeks. A high-fat diet decreased the relative gastrocnemius muscle weight in both age groups, and obesity and aging individually result in a decline in muscle function. Immunoreactivity of collagen IV, the main component of BM, BM width, and BM-synthetic factor expression in young mice on a high-fat diet were higher than that in young mice on a regular diet, whereas such changes were minimal in obese older mice. Furthermore, the number of central nuclei fibers in obese older mice was higher than in old mice fed a regular diet and young mice fed a high-fat diet. These results suggest that obesity at a young age promotes skeletal muscle BM formation in response to weight gain. In contrast, this response is less pronounced in old age, suggesting that obesity in old age may lead to muscle fragility.

The localization and function of synaptotagmin (syt)17 in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the brain, which is the master circadian oscillator, were investigated. The Syt17 mRNA-containing neurons were mainly situated in the shell region while SYT17 immunoreactive cell bodies and neural fibers were detected in the core and shell of the SCN and the subparaventricular zone (SPZ). Further, electron microscopy analysis revealed SYT17 in the rough endoplasmic reticulum (rER), Golgi apparatus (G), and large and small vesicles of neurons. Syt17 mRNA expression in the SCN showed a circadian rhythm, and light exposure at night suppressed its expression. In addition, the free running period of locomotor activity rhythm was shortened in Syt17-deletion mutant mice. These findings suggest that SYT17 is involved in the regulation of circadian rhythms.

In mammals, the center of the circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. Many studies have suggested that there are multiple regions generating different circadian periods within the SCN, but the exact localization of the regions has not been elucidated. In this study, using a transgenic rat carrying a destabilized luciferase reporter gene driven by a regulatory element of Per2 gene (Per2::dLuc), we investigated the regional variation of period lengths in horizontal slices of the SCN. We revealed a distinct caudal medial region (short period region, SPR) and a rostro-lateral region (long period region, LPR) that generate circadian rhythms with periods shorter than and longer than 24 hours, respectively. We also found that the core region of the SCN marked by dense VIP (vasoactive intestinal peptide) mRNA-expressing neurons covered a part of LPR, and that the shell region of the SCN contains both SPR and the rest of the LPR. Furthermore, we observed how synchronization is achieved between regions generating distinct circadian periods in the SCN. We found that the longer circadian rhythm of the rostral region appears to entrain the circadian rhythm in the caudal region. Our findings clarify the localization of regionality of circadian periods and the mechanism by which the integrated circadian rhythm is formed in the SCN.

We investigated the effect of aging on the basement membrane during post-injury muscle recovery. Using a rat model, we found that aging delayed muscle fiber and basement membrane recovery. In addition, expression of basement membrane-related factors peaked 7 days after muscle injury among both young and older rats. Peak expression of collagen IV synthetic factors decreased with age, whereas expression of the degradative factor was unaffected by age. These results suggest that age-related delays in post-injury muscle fiber and basement membrane recovery may be related to suppression of collagen IV synthetic factors.

The basement membrane (BM)-related factors, including collagen IV, are important for the maintenance and recovery of skeletal muscles. Aging impairs the expression of BM-related factors during recovery after disuse atrophy. Muscle activity facilitates collagen synthesis that constitutes the BM. However, the effect of endurance exercise on the BM of aged muscles is unclear. Thus, to understand the effect of endurance exercise on the BM of the skeletal muscle in aged rats, we prescribed treadmill running in aged rats and compared the differences in the expression of BM-related factors between the aged rats with and without exercise habits. Aged rats were subjected to endurance exercise via treadmill running. Exercise increased the mRNA expression levels of the BM-related factors, the area and intensity of collagen IV-immunoreactivity and the width of lamina densa in the soleus muscle of aged rats. These finding suggests that endurance exercise promotes BM construction in aged rats.

The circadian rhythms are endogenous rhythms of about 24 h, and are driven by the circadian clock. The clock centre locates in the suprachiasmatic nucleus. Light signals from the retina shift the circadian rhythm in the suprachiasmatic nucleus, but there is a robust part of the suprachiasmatic nucleus that causes jet lag after an abrupt shift of the environmental lighting condition. To examine the effect of attenuated circadian rhythm on the duration of jet lag, we established a transgenic rat expressing BMAL1 dominant negative form under control by mouse Prnp-based transcriptional regulation cassette [BMAL1 DN (+)]. The transgenic rats became active earlier than controls, just after light offset. Compared to control rats, BMAL1 DN (+) rats showed smaller circadian rhythm amplitudes in both behavioural and Per2 promoter driven luciferase activity rhythms. A light pulse during the night resulted in a larger phase shift of behavioural rhythm. Furthermore, at an abrupt shift of the light-dark cycle, BMAL1 DN (+) rat showed faster entrainment to the new light-dark cycle compared to controls. The circadian rhythm has been regarded as a limit cycle phenomenon, and our results support the hypothesis that modification of the amplitude of the circadian limit cycle leads to alteration in the length of the phase shift.

The basement membrane (BM), with collagen IV as a major component, plays an important role in the maintenance of muscle structure and its robustness. To investigate the effects of aging on factors related to BM construction, we compared the expression status of these factors in 3- and 20-month-old male Wistar rats. The expression levels of Col4a1 and Col4a2 (encoding collagen IV), Sparc (involved in collagen IV functionalization), and Mmp14 (a collagen IV degradation factor) were decreased. These results suggest that aging suppresses collagen IV synthetic and degradative factors and affects BM-related factors in the steady state.

PURPOSE: Collagen IV is a component of the basement membrane (BM) that provides mechanical support for muscle fibers. In addition, transcription factor 4 (TCF4) is highly expressed in muscle connective tissue fibroblasts and regulates muscle regeneration. However, the expression of collagen IV and TCF4 (+) cells in response to exercise-induced muscle injury is not well-known. Here, we investigated the expression and localization of collagen IV and TCF4 (+) cells during the recovery process after muscle injury induced by different exercise loads. MATERIALS AND METHODS: Muscle injury was observed in the soleus muscle of young Wistar rats after 12 or 18 sets - downhill running (DR) on a treadmill. After running, the rats were permitted to recover for a period of 0.5 days, 2 days, or 7 days. RESULTS: Ectopic localization of collagen IV in injured muscle fibers was observed after DR, and the number increased at 0.5 days after 18 sets DR and at 2 days after 12 or 18 sets - DR as compared to the number observed at baseline. BM disruption was observed after DR. TCF4 (+) cells appeared in the inside and around injured muscle fibers at 0.5 day of recovery. After 18 sets DR, TCF4 (+) cells were more abundant for a longer period than that observed after 12 sets DR. CONCLUSIONS: DR induces BM disruption accompanied by muscle fiber damage. It is possible that BM destruction may be accompanied by muscle damage and that TCF4 (+) cells contribute to muscle fiber and BM recovery.

Entrainment of mammalian circadian rhythms requires receptor-mediated signaling in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), the site of the master circadian pacemaker. Receptor-mediated signaling is regulated by endocytosis, indicating that endocytosis-related proteins contribute to SCN pacemaking. Sorting nexin 25 (SNX25) belongs to the sorting nexin superfamily, whose members are responsible for membrane attachment to organelles of the endocytic system. In this study, we showed that Snx25 mRNA and SNX25 protein are highly expressed and exhibit remarkable circadian rhythms in the SCN of adult mice. Expression was maximal at about zeitgeber time (ZT) 16 in the subjective night and minimal at ZT8 in the subjective day. Prominent SNX25 immunoreactivity was found in the arginine vasopressin-positive neurons of the SCN. These findings suggest that SNX25 is a new actor in endocytic signaling, perhaps contributing to the circadian pacemaking system.

ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 2 (ST8SIA2) synthesizes polysialic acid (PSA), which is essential for brain development. Although previous studies reported that St8sia2-deficient mice that have a mixed 129 and C57BL/6 (B6) genetic background showed mild and variable phenotypes, the reasons for this remain unknown. We hypothesized that this phenotypic difference is caused by diversity in the expression or function of flanking genes of St8sia2. A genomic polymorphism and gene expression analysis in the flanking region revealed reduced expression of insulin-like growth factor 1 receptor (Igf1r) on the B6 background than on that of the 129 strain. This observation, along with the finding that administration of an IGF1R agonist during pregnancy increased litter size, suggests that the decreased expression of Igf1r associated with ST8SIA2 deficiency caused lethality. This study demonstrates the importance of gene expression level in the flanking regions of a targeted null allele having an effect on phenotype.

The suprachiasmatic nucleus (SCN) is the center of the mammalian circadian system. Environmental photic signals shifts the phase of the circadian rhythm in the SCN except during the dead zone, when the photic signal is gated somewhere on the way from the retina to the neurons in the SCN. Here we examined the phase of the dead zone after an abrupt delay of the LD cycles for several days by observing the mc-Fos induction in the SCN by light pulses. After an abrupt shift of the LD cycles, the dead zone showed a slow phase shift, about two hours per day, which was well corresponded with the slow phase shift of the rest-activity cycles. In our previous study we demonstrated that, after an abrupt shift of the LD cycles, the SCN showed transient endogenous desynchronization between shell and core regions that showed a slow and a rapid shift of the circadian rhythms, respectively. Therefore, the present findings on the phase shift of the dead zone after the LD cycles shift suggest that the phase of the dead zone is under the control of the timing signals from the shell region of the SCN.

Sleep regulation involves interdependent signaling among specialized neurons in distributed brain regions. Although acetylcholine promotes wakefulness and rapid eye movement (REM) sleep, it is unclear whether the cholinergic pathway is essential (i.e., absolutely required) for REM sleep because of redundancy from neural circuits to molecules. First, we demonstrate that synaptic inhibition of TrkA+ cholinergic neurons causes a severe short-sleep phenotype and that sleep reduction is mostly attributable to a shortened sleep duration in the dark phase. Subsequent comprehensive knockout of acetylcholine receptor genes by the triple-target CRISPR method reveals that a similar short-sleep phenotype appears in the knockout of two Gq-type acetylcholine receptors Chrm1 and Chrm3. Strikingly, Chrm1 and Chrm3 double knockout chronically diminishes REM sleep to an almost undetectable level. These results suggest that muscarinic acetylcholine receptors, Chrm1 and Chrm3, are essential for REM sleep.

In mammals, the principal circadian oscillator exists in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN). In the SCN, CLOCK works as an essential component of molecular circadian oscillation, and ClockΔ19 mutant mice show unique characteristics of circadian rhythms such as extended free running periods, amplitude attenuation, and high-magnitude phase-resetting responses. Here we investigated what modifications occur in the spatiotemporal organization of clock gene expression in the SCN of ClockΔ19 mutants. The cultured SCN, sampled from neonatal homozygous ClockΔ19 mice on an ICR strain comprising PERIOD2::LUCIFERASE, demonstrated that the Clock gene mutation not only extends the circadian period, but also affects the spatial phase and period distribution of circadian oscillations in the SCN. In addition, disruption of the synchronization among neurons markedly attenuated the amplitude of the circadian rhythm of individual oscillating neurons in the mutant SCN. Further, with numerical simulations based on the present studies, the findings suggested that, in the SCN of the ClockΔ19 mutant mice, stable oscillation was preserved by the interaction among oscillating neurons, and that the orderly phase and period distribution that makes a phase wave are dependent on the functionality of CLOCK.

The mammalian circadian oscillator is composed of interacting positive and negative transcription events. The clock proteins PER1 and PER2 play essential roles in a negative limb of the feedback loop that generates the circadian rhythm in mammals. In addition, the proteins CLOCK and BMAL1 (also known as ARNTL) form a heterodimer that drives the Per genes via the E-box consensus sequences within their promoter regions. In the present study, we demonstrate that Id2 is involved in stabilization of the amplitudes of the circadian oscillations by suppressing transcriptional activation of clock genes Clock and Bmal1. Id2 shows dynamic oscillation in the SCN, with a peak in the late subjective night. Under constant dark conditions (DD), Id2(-/-) mice showed no apparent difference in locomotor activity, however, under constant light conditions (LL), Id2(-/-) mice exhibit aberrant locomotor activity, with lower circadian oscillation amplitudes, although the free running periods in Id2(-/-) mice show no differences from those in either wild type or heterozygous mice. Id2(-/-) animals also exhibit upregulation of Per1 in constant light, during both the subjective night and day. In wild type mice, Id2 is upregulated by constant light exposure during the subjective night. We propose that Id2 expression in the SCN contributes to maintenance of dynamic circadian oscillations.

哺乳類において、視交叉上核は体内時計の中枢と考えられている。この視交叉上核における各ペプチド含有細胞の分布、出力系、体内時計中枢のリセット（光同調）について形態学的な視点から解説した。また、我々の研究において解明した時差症候群（時差ボケ）の機序について紹介した。

哺乳類における体内時計の場所である視交叉上核とその中に存在する小領域と、体内時計はどうして変位するか。すなわち、日々の時刻合わせがどのようになっているかについて説明し、時差症候群の成り立ちについて説明をする。

視交叉上核（SCN）は，視交叉の直上に存在する一組の神経核であり，哺乳類概日リズムの中枢である．SCN は末梢時計を制御することだけでなく，外界の光環境の変化を認識する機構を備えている．概日リズムはリミットサイクルとよばれる物理現象と考えられており，視交叉上核における概日リズム発振細胞の振る舞いに理論的裏付けを与えている．視交叉上核の時計の位相を大きく変動させる入力は光である．光反応部と非光反応部をそなえる視交叉上核の解剖学的構築が時差ぼけの原因となっている．非光反応部では概日リズムが最大で1 日2 時間程度しかシフトしないため環境の明暗周期に同期するのに日数を要する．これが時差ぼけ（時差症候群）である．また視交叉上核内部には位相波とよばれる現象が現れ，同期を維持しながら日長を振動子間の位相差として視交叉上核内に蓄えるシステムであることが明らかになって来た．

2001年に行われた時間生物学札幌国際シンポジウムのproceedingである。体内時計の中枢である視交叉上核が、光条件に迅速に追随する部分となかなか環境に同調できない2つの領域によってなっており、それが時差ボケを引き起こしていることを述べた。

哺乳類概日リズムの中枢である視交叉上核(SCN)は、構成するそれぞれの神経細胞が固有の周期を持って概日リズムを発振している。細胞間の同期シグナルによって等周期の概日リズムを刻んでいる。一方、位相についてはサブ領域間で異なり、背側部の内側から外側に向かって位相波を生じていることを時計遺伝子Per1, Per2の発現解析により明らかになっている。 SCNの細胞間の同期にはcAMPによる位相伝達が必要であることが報告されていることから、今回、このシグナル伝達系を撹乱した際にSCN内の周期や位相がどのような影響を受けるかについて検索した。 （方法）新生児Per2::Lucラットの冠状断SCNスライスを作製し、その発光を冷却CCDカメラで経時的に記録した。cAMPシグナルを受容体非依存的に活性化するForskolinをSCNに継続的に作用させることで同期シグナルを撹乱した。周期と位相の解析には、SCNが外接するような格子状の長方形を設定し、各領域における発光の振動をsineの減衰

哺乳類体内時計の中枢である視交叉上核（SCN）は構成する神経細胞が同期し、概日のリズムを発振する。これらの細胞は個々に解離した状態では様々な周期を示すことが知られているが、それらがSCNでどのように分布しているかは不明であった。我々はラットPer2::lucのSCNスライスにcAMP合成酵素であるアデニル酸シクラーゼを活性化するホルスコリンを継続的に添加した際の周期への影響を測定した。観察したSCNの画像を格子状に分割し、それぞれの区画においてlucの発光が示す振動を解析すると、SCNの同期状態が失われていることを発見した。この時、24h未満の周期を持つ短周期の領域（SPR）はSCNの内側の小領域に限局し、24時間よりも長周期の領域（LPR）は外側に存在するという領域特異性を持っていた。興味深いことに、SPRはSCNでPerの発現が内側から外側へと位相差を持って伝播する位相波の起点領域と一致していた。また、Per1, Per2の発現解析からこの位相差は短日条件から長日条件

哺乳類において、主観的夜の光照射は概日リズムのシフトを生じ、その際には視交叉上核にてPer遺伝子の誘導に伴いシフトが生じると考えられている。一方、主観的昼の光照射に対しては概日リズム位相は変化せず、主観的夜の光照射で誘導されるcfos、Per1遺伝子誘導も生じない。このように光入力があっても視交叉上核がシフトしない機構(ゲート)についてはその機序がほとんど明らかになっていない。今回、このゲート位相を規定しているのが視交叉上核の背内側部(光非反応領域)か腹外側部(光反応領域)かを検討した。そのために明暗サイクルを10時間後退させて腹外側部と背内側部を脱同期させ、その後恒暗条件下で１、3，7日目(シフト当日を１日目)に、あるいは明暗条件を保ったまま１日目から4日目までの暗期に２時間おきに30分間光照射を行った後サンプルを採取し、視交叉上核におけるcfos、Per1遺伝子の誘導を in situ hybridization法を用いて観察した。その結果は背内側部がゲート

哺乳類体内時計における最大の同調因子は光である。しかしながら視交叉上核(SCN)において光の変化、強さ、長さ等の情報がどのように表現されているのか、その詳細は明らかではない。そこでこの問題を明らかにするために、恒暗条件下のマウスに主観的夜の前半及び後半で光照射を与えた後、SCNに発現するRNAを抽出し、GeneChipを用いて光応答遺伝子の包括的解析を行った。その結果、光照射後に発現が上昇する240遺伝子及び発現が抑制される45遺伝子を同定した。さらに光照射後に発現が上昇する遺伝子群に対して主成分分析を行った結果、光照射30分後に発現がピークに達し急速に減少する遺伝子(early type)と、120分後に発現がピークに達しゆっくりと減少する遺伝子(late type)の2つの反応パターンがあることを見出した。その反応パターンよりearly typeは光の変化、late typeは光の強さ、長さを感知しているのではないかと考え、マウスに光の長時間照射を与えたところ、SCNにおいてearly type

視交叉上核における周期の異なる２振動体とそれによって生じる視交叉上核内の位相波について数理モデルを構築し発表した。

視交叉上核における時差ぼけと視交叉上核背側部の周期の異なる領域について述べた。

視交叉上核からの位相情報を末梢時計に伝える主要な因子の１つに、グルココ ルチコイドがある。我々は末梢時計の位相制御におけるグルココルチコイドの関 与を調べるために、以下の実験を行った。 内因性のグルココルチコイドの影響を避けるため、実験にはADXラットを用い た。7日間にわたり、本来の内因性リズムとは逆位相であるZT0.5にコルチコステ ロン3mg/kgまたは27mg/kgを投与し、7日目にサンプリングを行った。肝臓、腎臓 のrPer1, rPer2, rCry1, rBmal1mRNA量を測定したところ、肝臓ではいずれの遺 伝子の発現リズムの位相も対照群と変化が見られなかった。しかし、腎臓では rPer2, rCry1, rBmal1の遺伝子発現リズムが対照群とは逆位相に変化していた。 肝臓の末梢時計は位相の変化が見られなかったことから、他の同調因子によって 位相が固定されていることが示された。我々はこの同調因子を摂食性のものと考 え、次にZT4-7の制限給餌とZT11.5のコルチコステロ

プロキネティシン受容体2を欠損したKOマウスでは嗅球での発生異常が生じる。とくに、糸球体層が欠損することが特徴的である。今回、このKOマウスにおける嗅球ドーパミン細胞は、成体では、野生型と比較して、細胞数が減少している。このドーパミン細胞の発生時の異常について検討を行った。ドーパミンニューロンを検出するためには、ドーパミンの合成酵素であるチロシン水酸化酵素の抗体を用いた。KOマウスの嗅球において、胎生13.5日, 16.5日では陽性細胞の数、サイズにおいて、野生型マウス（WT）との差は無かった。しかし、出生後１日では、野生型で明らかな数およびサイズの増大があったのに対して、WTでは、胎生期との変化はほとんど無かった。これは、嗅球ドーパミン細胞の主な障害は遊走時の障害ではなく、嗅球における成熟の異常であることを示唆する。

視交叉上核の腹外側部と背内側部の同期を保つメカニズムを明らかにするために、micropunchを用いてDMSCNとVLSCNのRNAを採取し、広範囲の遺伝子発現分析を行った。その結果、VIPとVpac2レセプターが抽出された。in situ hybridizationによってVIPとVpac2レセプターmRNAがVLSCNとDMSCNに限定されることが証明された。培養SCNにVIPとVPAC2作用薬を作動させた。すると、DMSCNとVLSCNを分離することによって、DMSCNのみ10時間もの大きなシフトを示した。VIPとVpac2システムがおそらくLDサイクル・シフトの後の視交叉上核再同期のメディエーターであることを示唆する。

時差ぼけの際に体内時計中枢である視交叉上核の腹外側部と背内側部の脱同期が生じる。それが同期状態になるまでに要する期間が前進して同期する場合と、後退して同期する場合で異なることが知られている。この現象について、シミュレーションによって、解析を行った。

視交叉上核(SCN)は網膜から直接投射する腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に分けられ、これらが強固に同期していることが知られている。しかし、SCN組織切片を作製し、長期間培養すると安定した振動の後に、やがて振動の減衰が観察される。このことは薬物添加による再同調では振動が回復することから、細胞間の脱同期の結果と考えられる。 今回、SCN切片作製後に各領域の周期変化を追跡することで、細胞間がどのように脱同期するかを観察した。実験はmPer2::lucラットのSCN組織培養を作製し、細胞レベルの発光をCCDカメラによって経時的に捉えることによって周期を測定した。 この結果、切片作製僅か数日後において周期が大きく異なる細胞が現れた。このときDMSCNの最背側部では24時間よりも短い周期の細胞が、またVLSCNでは24時間よりも長周期の細胞が存在した。さらに新生児SCNにおいて同様の解析を行ったところ、成体とは異なりDM-VL間は切片作製後も長期間同期

すでにC6細胞、および視交叉上核におけるsynaptotagmin17(SYT17) mRNA の概日リズムについて報告した。本研究ではSYT17タンパクの局在について検討した。SYT17抗体による免疫電顕では、C6細胞細胞体の小胞膜および、細胞突起の細胞膜とその直下の小胞膜上にSYT17を検出した。視交叉上核では、視交叉上核全体に広く発現し、さらに外側に伸びる突起にも陽性反応を観察した。GFAP抗体との二重染色では、視交叉上核の多くの細胞でGFAP,SYT17の共発現を示した。アストロサイトでのSYT17の発現が示唆された。

視交叉上核(SCN)の個々の神経細胞は細胞間同期が存在しなければ、多様な周期の概日リズムを発振することが明らかになっている。よって、SCNが単一周期を発振するためには細胞間の同期を必要とする。今回、ペプチド受容体の局在を検討することによってSCNにおける領域間同期機構を検討した。SCNは、網膜からの投射がある腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に区分され、VLSCNにはVIP、GRP産生細胞が、DMSCNにはAVP産生細胞が局在する。そこで、これらの受容体であるVIP受容体 (VPAC2)、AVP受容体(V1a)、GRP受容体(GRPR)の局在をin situ hybridization 法を用いてラットSCNにおいて検討した。その結果、V1a mRNA発現細胞は主にDMSCNに強く発現した。また、VPAC2 mRNA発現細胞はDMSCNおよびVLSCN内の背側領域、GRPR mRNA発現細胞はVLSCNに密に局在した。これらの結果は、VIP産生細胞がVLSCNからDMSCNへの情報伝達に関与していることを示す。さらにAVPとGRP産生細胞はそれぞれDMSCNおよび、VLSCNにおけるautocrineまたはpara

C6細胞において、Dex刺激後、synaptotagmin17(SYT17) mRNA の概日リズムを検出した。刺激後16時間および40時間をピークとする振動であった。同様な振動は視交叉上核(SCN)でも認められ、夜に高く昼に低い発現を得た。。SYT17はCa2+依存的に小胞の膜融合に働くと考えられている。Astrogliaからは神経伝達物質であるglutamateが放出されることも知られており, 日内変動を持って発現するSyt17は、何らかの液性因子の日内変動を示す分泌に関与しているかもしれない。

体内時計の中枢である視交叉上核(SCN)は、網膜からの投射がある腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に区分される。急激な明暗サイクルのシフトに対してVLSCNの概日リズムは１日で新しい明暗条件に同調するが、DMSCNはより日数を費やして位相変位して再同調に至る。この再同調は、VLSCNの位相にDMSCNが引き込まれる様式になっており、VLSCNから DMSCNへの一方向性の位相情報の伝達様式を示唆する。そこで、VLSCNからDMSCNへ作用する伝達物質を同定するために各領域の包括的遺伝子解析を行い、DMSCNに有意に高く発現している遺伝子を検索した。その結果、VIPの受容体であるVPAC2がDMSCNに強く発現していた。さらに、in situ hybridization法によってVPAC2 mRNA発現細胞はDMSCNのみに密に存在することが確認できた。VLSCNにはVIPが強く発現していることから、VLSCNからDMSCNにVIPがVPAC2受容体を介して位相情報の伝達を行っていることが示唆された。

【目的】光刺激に対する視交叉上核（SCN）は網膜からの直接の投射が存在する腹外側部（VLSCN）と投射のない背内側部（DMSCN）に分けられる。すでに我々は、この２つの領域の概日リズムが明暗サイクルのシフトによって脱同期すること、それが原因で時差症候群を引き起こしていることを明らかにしている（J. Neurosice. Nagano et al. 2003）。今回、VLSCNとDMSCNとの外部入力に対する応答の差異がどこに起因するのかを検討した。【方法】mPer2 promoterの制御下でluciferase遺伝子を発現するラットSCNの組織スライス培養を作製し、発光を経時的にモニターすることによって、概日リズムを捉えた。組織スライス培養にadenylate cyclaseを賦活化するforskolinを作用させ、概日リズムの変化を微量光測定装置およびCCDカメラを用いて検討した。一方でラット VLSCNとDMSCNの組織を個別にパンチアウトしたのちRNAを採取し、DNAマイクロアレイによって発現解析を行った。得られた結果から領域特異的に発現する受容体

視交叉上核からの位相情報を伝える制御因子には様々なものが報告され ているが、主要な因子の１つとして副腎から分泌されるグルココルチコイドがあ る。我々はグルココルチコイドが末梢臓器の時計機構に与える影響を調べるため に、以下の実験を行った。 副腎を除去(ADX)したラットを作成し、対照群と共に一日を通して4時間おきに6 点でサンプリングを行った。肝臓、腎臓からmRNAを抽出し、定量的PCR法で時計 遺伝子rPer1, rPer2, rCry1, rBmal1のmRNA量の日内変動を測定した。その結 果、いずれの遺伝子とも位相に変化は見られなかったが、ADXラットのrPer1は肝 臓、腎臓ともに日内変動の振幅が大幅に減衰していた。rPer2, rCry1, rBmal1 は、肝臓では大きな変化が見られなかった。しかし、興味深いことに腎臓では日 内変動の振幅が大きく減衰していた。 次に、末梢時計の位相制御におけるグルココルチコイドの関与を調べた。内因性 のグルココルチコイドの影響を

視交叉上核(SCN)は網膜から直接の投射が終止する腹外側部(VL-SCN)と直接の投射のない背内側部(DM－SCN)の領域に明瞭に区分される。生物の体内時間に対して明暗周期を大きく変動させると、VL-SCNにおける時計遺伝子の発現リズムは新たな明暗周期に短時間で同調するのに対し、DM-SCNにおける同調には長時間を要するため、このことが時差症候群あるいは時差ぼけの原因になることを我々はこれまでに示してきた。しかしながらSCN内における領域的な同調様式の違いがどのように生じるかについてはまだ明らかになっていない。今回我々はmPer2::lucを発現するラットを用い、SCNの組織スライス培養を作成することで刺激に対するSCNの反応性を検索した。まず、cAMPのシグナル経路を賦活化するforskolinをSCNに作用させ、luciferineの概日発光リズムを微量光測定装置によって測定することで位相応答を調べたところ、forskolinへの刺激応答には明確な位相依存性が存在することが明らかになった。次に、mPer

時差ぼけの際に視交叉上核の腹外側部と背内側部が脱同期し、背内側部の位相の変位が遅延して、時差ぼけ症候を生じることが知られている。これらの時日から２つの振動体を視交叉上核に想定して、数理モデルを作成した。時差ぼけの修復、すなわち視交叉上核の再同期にかかる日数は後退に比較して、前進に日数をより要することが知られている。視交叉上核の遺伝子発現を忠実に再現しようと、非線形性を強める課程で、前進と後退の非対称性が表れた。

視交叉上核が日の長さを記憶し、それに伴って動物の行動に変化が生じることが知られている。視交叉上核にはMオシレーターとEオシレーターが存在し、その二つの振動子の位相差が調整されることによって、行動に変化が生じると考えられている。さて、視交叉上核は腹外側部と背内側部に別れる。我々は、背内側部が日長によって、その内側と外側部の位相差が拡大することを発見した。すなわちMオシレーターとEオシレーターがこの位相が乖離した２つの部分で構成されている可能性が高い。さらに、どうして、このような位相差が生まれるかについて、モデルを作成した。

我々はグルココルチコイドの時刻情報伝達因子としての性質に注目し、 その血中濃度の日内リズムが臓器にリズム情報を伝えている可能性を検証した。 グルココルチコイドを産生する副腎を除去（ADX）したラットを作成し、肝臓、 腎臓での遺伝子発現を径時的に調べたところ、肝臓で時計遺伝子rPer1の発現の 減衰が認められた。一方、腎臓ではrPer1, rPer2, rCry1, rBmal1において、発 現リズムの振幅が大きく減衰していた。リズムの位相は肝臓、腎臓とも変化がな かった。ADXラット腹腔内へのコルチコステロン投与により、肝臓、腎臓での rPer1の発現が誘導された。しかし、rPer2の発現は誘導されなかった。この結果 から、rPer1発現リズムの減衰はグルココルチコイドの欠失によるものと考えら れたが、腎臓ではrPer2, rCry1, rBmal1の発現リズムも減衰していたことから、 rPer1の発現リズムがフィードバックループ全体の振幅の維持に関与している、 あるいはADXによって消

体内時計の中枢である視交叉上核に日長の変化がどのような影響を持つかを明らかにするために、時計遺伝子Per1遺伝子発現をin situ hybridizationを用いて検討した。その結果、背内側部の脳室近傍領域におけるPer1遺伝子の発現開始が早まり、それより外側の領域では、発現の終了が遅くなっていた。また長日の１日目では、腹外側部のPer1遺伝子の誘導時刻が早まったのに加え、背内側部の脳室近傍領域におけるPer1遺伝子の発現開始も早くなった。このことから、長日条件においては光条件の変化に伴い、背内側部のPer1発現が修飾され、発現ピーク時刻のずれおよび発現の延長をもたらしていることが示唆された。

生物時計の分子機構を明らかにするために、概日時計の位相に依存してリン酸化、脱リン酸化されるタンパクに注目しプロテオーム解析を行った。リン酸化の変動をうかがわせるいくつかのタンパクのうち、Elongation factor2 (EF2)について検討し、リン酸化の概日リズムを明らかにした。

我々は、体内時計の位相の指標として視交叉上核におけるPer1、Per２遺伝子の発現量を解析することで体内時計の示す位相を知ることができることを見出した。そこで、本シンポジウムでは、光が体内時計中枢の視交叉上核に及ぼす影響について、急激な明暗周期のシフトにより生じる時差症候群の分子機序、夜間の一回の光照射によって視交叉上核に一週間以上の影響を及ぼすこと、明期を延長することによって、視交叉上核の腹外側部と背内側部の非同期があらわれてくることなど、最近我々の教室で得た知見を空間軸および時間軸で解説した。

シンポジウム 「生理機能を支配する末梢の時計：生物リズム研究の新展開」にての発表。哺乳類の体内時計は中枢である視床下部視交叉上核がマスタークロックとして末梢の時計を制御する階層的システムをなしている。このような末梢時計のコントロールがどのような機序で生じているのかについて、検討を加えた。視交叉上核を破壊したマウスに対して、胎児の視交叉上核を移植し、末梢時計の運行が開腹するかと行った検討、および、副腎から分泌される液性因子（ホルモン）によって、肝、腎の時計が制御されているのかどうかについての検討について発表した。

体内時計の中枢である視交叉上核において、Per1, Per2遺伝子発現の日周変動における日長時間の影響をin situ hybridization法を用いて検討した。その結果、長日明暗サイクル（明期１６時間、暗期８時間）で飼育したラット視交叉上核において、Per1, Per2遺伝子発現周期に網膜からの直接入力がある腹外側部領域と投射のない背内側部領域との脱同調が認められた。これらのことから、日長時間の変化は、網膜からの直接入力がない背内側部領域においても影響を及ぼすことが明らかとなった。（英文）

光環境の違いによって生じる体内時計中枢視交叉上核の多様性について述べた。（英文）

Prokineticin(PK1/PK2)は分泌性のタンパク質で、Gタンパク質共役受容体(GPCR)であるProkineticin 受容体(PKR1/PKR2)を介して、様々な生理的機能に関与する。PKR1とPKR2の生体内での働きを検討するため、PKR1とPKR2遺伝子欠損マウスを作成し、形態学的解析を行った。その結果、PKR2遺伝子欠損マウスのみに、明らかな形態異常、すなわち、嗅球および、生殖器の形成不全が生じていた。さらに生殖器の形成不全の原因について、検討を加え、中枢性の性腺機能不全であることが明らかとなった。また、胎児のnasal regionを検索すると、鋤鼻神経が前脳にいたらず途絶していることが判明し、GnRHニューロンの前脳への遊走の障害が、生殖腺の形成不全の原因と考えられた。

体内時計中枢である視交叉上核に発現し、行動を抑制する作用があるとされるProkineticin2(PKR2)とその中枢神経系での受容体であるPK受容体２（PKR2）の視交叉上核における分布について報告した。PK2が背内側部、腹外側に発現するのに対して、PKR2は背内側部に発現していた。背外側部は、発現が概日振動を示す時計遺伝子Per1が遅れて発現することから、視交叉上核内部における位相差にPK2ーPKR2の相互作用が何らかの役割を持つことを示唆する。さらに、PKR2遺伝子KO mouseでは、活動のリズムは残るものの変動が小さいこと、総活動量が減ること、夜の終わりに活動が上昇することなどを報告した。

主観的夜の一回の光照射の位相変位に対する影響を検討した。そして、恒常暗条件においては光照射によって、腹外側部が振動体として働くようになり、その位相情報が数日間にわたって背内側部に伝達され最終的に位相変位が達成されることが示唆される結果を得た。

体内時計中枢である視交叉上核に発現し、行動を抑制する作用があるとされるProkineticin2(PKR2)とその中枢神経系での受容体であるPK受容体２（PKR2）の視交叉上核における分布を検討した。PK2が背内側部、腹外側に発現するのに対して、PKR2は背内側部に発現していた。背外側部は、発現が概日振動を示す時計遺伝子Per1が遅れて発現することから、視交叉上核内部における位相差にPK2ーPKR2の相互作用が何らかの役割を持つことを示唆する。

視交叉上核（SCN)は哺乳類の概日時計の中枢である。SCNの破壊によって概日リ ズムが失われたマウスに他のマウスのSCNを移植すると、ホストマウスと移植さ れたSCNとの神経連絡が不完全であるにもかかわらず概日活動リズムが回復す る。われわれは移植されたSCNがホストマウスの末梢組織にどのような影響を与 えるのかを調べた。その結果、移植SCNはホストの末梢組織に概日リズムを発生 させることが明らかとなった。ホストマウスの末梢組織の時計遺伝子発現はイン タクトマウスと同様に日周変動していた。しかし、Period1, Period2では振幅が 大きく減少していた。これらのことから、移植されたSCNからの時刻情報は末梢 組織の時計機構を制御するが、時計遺伝子によって異なる制御を受けていること が示唆された。(英文）

視交叉上核における神経とグリアの概日リズム形成への関与について、樹立したグリア細胞株や視交叉上核の培養スライスの共培養等で検討した結果、グリア細胞が概日リズムに積極的に影響を与えているという知見が得られ、神経のみで説明されていた概日時計機構に新たなモデルを提唱することとなった。

T-cycleを用いて、前進、あるいは後退を必要とする明暗条件を作り、Per1, Per2遺伝子の光同調での使い分けについて検討した。そして、主観的夜の終わりにPer1にのみ依存した、主観的夜の始まりにPer2にのみに依存した位相変位が生じる概日時計の位相があり、その位相ではPer1が前進に、Per2が後退といった使い分けが生じていることを示唆する結果を得た。

視交叉上核（SCN）移植動物における、末梢組織の概日振動の有無とその位相を調べるために、SCN移植マウスの肝臓、腎臓、骨格筋をサンプリングし、時計遺伝子のmRNA量をリアルタイムPCR法で測定した。時計遺伝子は各臓器とも、対照群と同位相の概日リズムを示したことから、移植されたSCNは行動リズムだけでなく、末梢組織の概日振動を制御することが明らかとなった。

PK2 の視交叉上核（SCN）における役割を明らかにするためPK2と、PK2の受容体であるprokineticin receptor 2 (PKR2)のラットSCNでの局在を調べた。rPK2 mRNAは主観的昼にピークを持つ日周変動を示した。一方、rPKR2 mRNAは日周変動を示さず、SCNの背外側の小領域にのみ、陽性細胞が密に存在していた。これらの所見はSCNでPK2による神経伝達があることを示唆する。

体内時計を制御する重要な時計遺伝子であるmPer1とmPer2の視交叉上核における発現をそれらのイントロンの部分をコードしたプローブを用いて検討した。

マウスやラットの体内時計中枢である視交叉上核において、12時間明期: 12時間暗期の条件下では、Per1、Per2遺伝子の発現が明期と暗期の開始の前後に異なる様式で誘導されており、両遺伝子が内因性のリズムを24時間に同調させる機能を果たしている可能性を強く示唆した。

視交叉上核（SCN）の腹外側部（VLSCN）において、背内側部（DMSCN）と同様に明暗（LD）、恒暗（DD）条件下においてもPer 1の日周変動が認められるが、DD条件下ではその振動はLD条件と比較してかなり減弱する。そこで、in situ hybridizationを用いて同様の領域が存在するかを検討した。特にVLSCNの最も腹側に、１日を通してほとんど陽性細胞のない小領域を認めた。このことから、VLSCNにおいて自律性リズムを持つ細胞群と自身では振動せず、光刺激によりPer 遺伝子が誘導される細胞群が存在すると考えられる。

ラットSCNにおけるrPK2 mRNAの発現リズムとその局在について、Digoxigenin-labeledプローブを用いたin situ hybridization調べた結果、rPK2 mRNA発現ニューロンはSCNにおいて広く散在していることがわかった。またSCNにおけるPK2の光応答について調べた。その結果、PK2は主観的夜の前半よりも主観的夜の後半で強い光応答をすることが確認できた。

光同調メカニズムにおけるPer1、Per２の役割について検討するため、ラットにおいて、明暗周期を延長して、体内時計を後退させなければならない環境を作り、その際のPer1、Per２発現をin situ hybridization で観察した。その結果、２５時間の明暗サイクルで明期の終わりに、視交叉上核の腹外側部にPer２の強い発現を観察した。そして、Per1が位相前進にPer2が位相後退に働くことを示唆した。

Prokineticin 2 (PK2)はSCNにおいて強い発現リズムを示し、哺乳類の行動活動を抑制することが知られている。そこで我々はDigoxigenin-labeledプローブを用いたin situ hybridizationにより、ラットSCNにおけるrPK2 mRNAの発現リズムとその局在について調べた。その結果、rPK2 mRNA発現ニューロンはSCNの背内側部、腹外側部のどちらの領域にも広く散在し、各領域において強い振動を示した。またrPK2 mRNA発現ニューロンは複数のペプチドのmRNAと共発現していることがわかった。

これまでの研究でRNAの安定性が概日リズムの制御に重要なことが明らかとなった。我々は遺伝子の転写をより正確にとらえるために、重要な時計遺伝子の一つであるmPer2のイントロンをコードしたプローブを用いたin situ hybridization法により、mRNA前駆物質の発現リズム及び光による誘導を検討した。その結果、イントロンの反応はmRNAプローブを用いた場合より先に発現のピークが見られることが明らかとなった。そのため、イントロンを用いたプローブは転写の制御を検討する上で非常に有効な方法であると考えられる

体内時計の中枢は視交叉上核に存在する。そのうち背内側部は網膜からの投射が無く、急激な明暗変化にすぐには同期できないため時差ぼけの原因となっている。今回我々は、明暗周期の１０時間の前進が、視交叉上核の背内側部の分裂を生じ、前進して同期するもの、後退して同期するものが生じることを明らかにした。

急激な明暗周期の変位に伴い、視交叉上核光反応部、腹外側部に振動体が形成される。それによって位相情報を背内側部に伝えると考えられた。

概日リズムは約２４時間周期をもつ生理的リズムで、その制御にはbHLHを持つ転写因子が重要な役割を示していることが知られている。Id2は HLHに結合し、転写を抑制することが知られ、概日リズムの制御への関与を調べるためにその発現の局在を検討した。

哺乳類における体内時計の光同調時期を同定するため、視交叉上核におけるPer1 の発現を検討した。その結果、２４時間より長い周期をもつラットは早朝の光刺激、２４時間より短い周期をもつマウスは夕暮れの光刺激が同調機構に重要な関係があると考えられた。

SHRSPの自由行動および自発運動についてWKYと比較検討した。その結果、運動量はWKYより少なく、加齢により低下した。

SHRSPの自由行動リズムとパターンをWKYと比較した。その結果、概日周期に差が無かったが、運動量はSHRSP1の方で少なかった。

ラット視交叉上核においてHSP遺伝子の時間依存的発現及び光照射による影響について検討した。その結果、視交叉上核においてHsp40 mRNAは、光刺激により発現が誘導され、網膜からの投射部位へのグルタミン酸の放出に対して細胞保護に働くことが示唆された。

長期にわたって光入力を断つことにより視交叉上核腹外側部のper1の日周変動にどのような変化を生じるかを検討した。結果から視交叉上核腹外側部のper1の振動の振幅は、光入力に依存したものであることが考えられた。

熱ショックタンパク質の遺伝子がマウス、ラット視交叉上核においてサーカディアンリズムを示しているかを検討した。その結果、マウスにおいて、HSP40 、HSP105、HSPa5の遺伝子発現は主観的夜に高く、主観的昼に低いリズミカルな発現パターンを示すことが明らかとなった。

体内時計の中枢は視床下部の視交叉上核に存在する。 急激な明暗サイクルのシフト後に腹外側部に概日振動子が一時的に生じる事を報告した。また、腹外側部の時計が一時的に大きな振動を生じてその位相を背内側部に伝えるとのモデルを提出した。

aquaporin 4は脳にみられる代表的な水チャンネルタンパクである。このタンパクが培養アストログリア細胞膜に発現するためには、C末端での二つの重要な部分が関与している。一つは疎水性部分、もう一つはPDZ結合領域である

マイクロアレイ法により視交差上核と肝臓において概日リズムを示す遺伝子をin situ法を用いて周期的発現及び発現部位の特徴を検討した。

時差ボケは哺乳類の体内時計が存在する視交叉上核の背内側領域が環境の変化に取り残されることから生ずると考えられる。

今回我々は明暗条件（12：12）で飼育した場合のラットの同調機構をrPer1の発現を示標として分子レベルで検討した。その結果、ラットは早朝と夕暮れの光刺激によって体内時計を環境のリズムに同調すると考えられる。

時計遺伝子の一つであるCry1が体内時計の位相変位の際どのような反応形式で位相変位を生じるのかについて検討した。

眼球欠損のラット（LOU/CN/Krm)を用い、視交叉上核における形態的変化について検討した。その結果、網膜からの投射が存在しないために各種のペプチド産生ニューロンの遊走に異常が生じた可能性があると考えられた。

ラットにおける体内時計の光による同調時期を同定するため、明暗条件下と恒暗条件下での視交叉上核におけるrPer1 の発現を検討した。その結果、ラットは早朝の光刺激が同調機構に重要な関係があると考えられた。

体内時計におけるCry1 の役割を明らかにすることを目的として、 馬血清処理後のrCry1発現の誘導について検討した。Cry1発現のピークは処理後4～8時間で、Per2のピークに約4時間遅れることが解った。

元来、発生の途中に脳室から遊走する神経細胞は、視交叉上核を形成するが、眼球欠損の場合、網膜からの直接投射に関係しないためVIP. GRPの細胞局在に変化を生じたものと思われる。

ラットの明暗サイクルを急激にずらすと、視交叉上核に２つの相異の異なる時計が生ずることが、明らかとなった。そしてこの２つの時計が再同調するのに5～7日かかることが、時差ボケの原因になると考える。

時差ボケの機序を検討するために急激に明暗サイクルをずらし、ラット視交叉上核におけるPer1mRNAの変化を観察した。その結果、明暗サイクルのシフト後、視交叉上核に位相の異なる２つの時計を生じ、それが再同調するのに５~7日かかることが判明した。

アクアポリン4(AQP4)の細胞膜局在機構を明らかにするため、種々の長さのAQP4変異体を作成し、蛍光顕微鏡下であるいは免疫細胞化学的に局在を検討した。AQP4の全アミノ酸301のうち、C末26アミノ酸を欠損させると、膜に局在しなかった

体内時計の光同調、視交叉上核の存在する体内時計の内的脱同調によって時差ボケの生じる仕組みについて述べた。

様々なアクアポリン4のＣ末変異体とGFPの融合タンパクを作製し、培養アストロサイトに発現させた。その結果、PDZドメインに結合すると考えられていたC末の配列はアクアポリン4の細胞膜への移行には関与しないことが分かった。

アクアポリン4(AQP4)の膜局在化機構についてAQP4-GFP融合タンパクを培養細胞に発現させ、その局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。様々な欠損変異体を作製し調べたところAQP4のC末部分に膜局在に重要だと思われる配列を見つけた。

我々は以前にマウス(C57BL/6J)で明暗サイクルを10時間後退させ、詳細に視交叉上核の水平断切片でPer1遺伝子発現パターンを観察し、視交叉上核のコア領域とシェル領域間の脱同期に加えて、シェル領域においてPer1遺伝子発現のピークが吻側部は尾側部より速く後退することを報告した。今回、Per2:: lucノックインマウス(Per2プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するコンス トラクトを導入したマウス)を用いて、明暗サイクルの10時間後退1日目と2日目において視交叉上核のスライス培養を作成し発光リズムを観察した結果、コア領域とシェル領域間の脱同期を認められたが、シェル領域内において明確な脱同期を確認することはできなかった。そこで、明暗サイクルを後退させた時よりも再同期に期間を要する明暗サイクルを前進させてシェル領域内において脱同期が生じるかを検討した。まず、マウス(C57BL/6J)で明暗サイクルを8時間前進させ、視交叉上核の水平断切片でPer1遺伝子発現をin situ hybridization法を用いて経時的に観察した結果、明暗サイクルを後退させて時よりも明確なシェル領域内における脱同期が観察された。現在、Per2:: lucノックインマウスによる検証を進めている。 概日リズムの減退が時差ぼけの持続時間に及ぼす影響を調べるため、時計遺伝子BMAL1のdominant negative formを発現するトランスジェニックラットを作成して検討した結果、このトランスジェニックラットは、対照群よりも早くlight off直後に活動的になった。また、明暗周期を急激に変化させた時に、このトランスジェニックラットは対照群に比べ、新しい明暗周期への同調が早いことが明らかとなった。

哺乳類は安定した約24時間の周期を示す内因性の生物時計をもっている。この機能を支えているのは視床下部にある視交叉上核(SCN)である。我々はこれまでにSCNの背内側領域にこの周期よりも短いリズムを発振する細胞群が存在することを明らかにし、その領域を起点とする位相波(時計遺伝子の発現が内外側方向に伝播する波)に着目してきた。今回、これまでに知られていた内外側方向への位相波の他に吻尾軸方向の位相波の広がりが存在することが、マウスSCNを用いた組織化学的な検索によってわかり、生理学的機能の不明な位相波について基礎的な理解が深まった。

我々は、視交叉上核サブ領域間の非同期時に内側部では24時間よりも短い周期が、外側部では24時間よりも長い周期が現れるという領域固有の周期の存在を見出してきた。短周期領域は位相波（内側から外側への時計遺伝子の連続的な発現）の起点であることや、位相波が日長時間の延長に反応することから、本課題ではこの領域の重要性に着目した。期間中に、短周期領域が尾側で拡張した構造をもつこと、他の領域に比して細胞密度が高いこと、さらにトランスクリプトーム解析、組織化学的解析によって短周期領域周辺に限局した分泌性因子を同定するともに、光パルス型の位相反応曲線を得ることで視交叉上核での位相調節機能について明らかにした。

視交叉上核(SCN)は網膜から直接投射する腹外側部(VLSCN)と投射のない背内側部(DMSCN)に分けられ、これらが強固に同期している。しかし、SCN組織切片の長期間培養で、振動の減衰が観察され、薬物添加による再同調では振動が回復することから細胞間の脱同期の結果と考えられる。そこで、Per2::lucラットのSCN組織培養を作製し、CCDカメラによって各領域の周期変化を追跡し、細胞間がどのように脱同期するかを観察した。その結果、切片作製数日後において周期が大きく異なる細胞が現れ、このときDMSCNの最背側部では24時間よりも短い周期の細胞が、また VLSCNでは24時間よりも長周期の細胞が存在することが明らかとなった。 つぎに、光によって体内時計中枢であるSCNの概日リズムがシフトする。この際、主観的夜の光照射はシフトを生じ、SCNでのcfos, Per1遺伝子の誘導を伴う。一方、主観的昼の光照射に対して体内時計位相は変化せずcfos, Per1も誘導されない。このように光入力があってもSCNがシフトしない機構をゲートと呼ぶ。そこで、このゲートの位相を規定しているのがSCNのDMSCNかVLSCNかを検討した。ラットの明暗サイクルを変化させて強制的にSCNに脱同期を生じさせた後、光によるSCNにおけるcfos、Per1遺伝子の誘導を経時的に観察し、VLSCNとDMSCNのいずれにゲート位相が一致するかを検討した。その結果、明暗サイクルをシフト後、DMSCNにおけるPer1遺伝子発現サイクルの位相は１日約2時間位相変位した。また、光によるVLSCNでのcfos遺伝子発現誘導も同様な位相変位を示した。このことから、SCNのDMSCNがゲートの位相を規定していることが明らかとなった。

体内時計中枢である視交叉上核における細胞間同期機構を検討した。その結果、背内側部および腹外側側部という機能が異なる2つの領域を同期しているのがVIPとVpac2受容体を用いた細胞間の情報伝達であることが示唆された。また、視交叉上核が周期の異なる2領域に分割できることが明らかになった。これを数値的にシミュレーションしたところ、視交叉上核に見られる位相波現象を再現することができた。

1.機能未知GPCRのクローニングおよびその機能についての検索。機能未知GPCR、GPRg1をクローニングした。特異的に中枢神経系に発現しており、尾状核被殻、手綱核、乳頭体などで強い発現を認めた。細胞への強制発現をおこない、Gq受容体特異的阻害剤を用いることによって、Gq/11にカップリングした受容体であることが明らかになった。(BBRC 2005) 2.Per1,Per2遺伝子が視交叉上核に誘導され、位相変位を生じる。Per1/Per2遺伝子が体内時計中枢である視交叉上核においてどのように使い分けられているのかを明らかにした。Per1依存性、Per2依存性の位相変位が生じるメカニズムが明らかになった(投稿中)。 3.Per2遺伝子誘導へいたる細胞内情報伝達経路を明らかにすることができた(Genes to Cells 2006)。Gqタンパク結合型受容体から、phospholipase C, IP3, IP3受容体、ERからの細胞内Ca2+放出、細胞外からの流入という一連の経路によって、Per2の誘導が引き起こされることが明らかになった。 4.グリオーマ細胞C6における概日リズムの発見した。グリオーマ細胞であるC6に顕著なサーカディアンリズムを認めた。(BBRC 2006)。 5.視交叉上核において振動する遺伝子として採取されたProkineticinとその中枢性の受容体であるProkineticin receptor 2(PKR2)の詳細な局在の検討。(European J.Neurosci.;2006) 6.PKR2ノックアウトマウスを用いた、PK2,PKR2システムの機能解析。PKR2ノックアウトマウスにおいては、嗅球の形成不全、性腺機能不全が生じた。Kallmann症候群の主要二症候を合併する初めてのマウスであった。(PNAS 2006)

以前我々がGeneChipで単離した発現が概日振動する遺伝子群の機能解析を迅速かつ多角的に遂行するために、以下の方法の開発・至適化とそれによる各遺伝子の機能解析を行ってきた。まず、各候補遺伝子を強制発現あるいは発現抑制するレンチウイルスベクターを作製し、産生した高力価のウイルスを用いてin vitroで機能解析を効率良く行う方法を確立した。次に、脳定位固定装置を用いて、体内時計の中枢である視交叉上核にレンチウイルスを注入し、遺伝子を強制発現(発現抑制)させた個体を作出することに成功した。これは従来の遺伝子導入マウスと異なり、ウイルスを感染させた個体をすぐに解析に使用できるので、複数の候補遺伝子の効率的な機能スクリーニングに適した方法である。我々は更に、脳のスライスに直接効率良くウイルスを感染させることにも成功した。これまで個体や組織に高率に遺伝子を導入することが困難だったことから、その手法の確立の意義は大きい。このような新たな手法の開発により、時計の中枢である視交叉上核での遺伝子操作が短時間で比較的容易に達成できるようになったので、我々は以下のように機能スクリーニングを進めてきた。第一に、視交叉上核で特定の遺伝子を強制発現(発現抑制)させたマウスを作製し、各個体の行動、体温等の概日リズムを測定する。恒暗、恒明条件、光パルスや明暗周期の変化が体内時計に及ぼす影響など細かい解析を行う。第二に、時計遺伝子Per2のプロモーターにluciferaseを連結したレポーターを導入したマウス・ラットから視交叉上核のスライスを作製し、そこにレンチウイルスを感染させて遺伝子を導入することにより、候補遺伝子の概日時計への機能的関与を解析する。更に、同じスライスでMEDシステムを用いた電気活動リズムの測定も可能である。以上の方法で、次々に候補遺伝子の機能スクリーニングを行っており、Rgs16とHmg4の概日時計における役割に関しての論文の発表準備中である。

1.視交叉上核における体内時計乖離現象の発見と時差ボケの機序の解明。 急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の腹外側部と背内側部でPerl遺伝子が異なる時間帯に発現することを示した。明期の開始時間を急に10時問遅らすと、ラットでも本来活動すべき暗期に、昼と同様の運動量が低下した時間が数日間にわたって生じる。すなわち、時差ボケがラットに生じたと考えられる。ここで、行動リズムとSCNの時計遺伝子の発現リズムの相関関係を検討した。新たな光周期に移った1日目からVL領域は再同調できたのにもかかわらず、光入力のないDM領域では、ゆっくりと一週間ほどかけて時計遺伝子の発現リズムは新たな光周期に同調していった。また、明暗周期を6時間前進させると、同様のDMとVLの解離を認めた。すなわち、VLのみが先に環境の明暗周期に同調し、DMは10日から14日をかけて、再同調がもたらされた。このさい、DM領域の再同調と行動リズムの再同調のパターンに強い相関関係を認めた。これはDMとVLの脱同調が時差ぼけの原因であることを示唆するものである。現在、再同調を早めるための試みを行っている。 2.視交叉上核における網羅的遺伝子採取と体内時計の夜に発現する遣伝子群に共通する転写応答配列の発見マウスの視交叉上核から取り出したRNAを用いて体内時計の夜を形作る遺伝子群を解明し、それを、ごく最近明らかになってヒトのゲノム配列と照らし合わせることによって、体内時計の夜の時間を作るのに重要な働きをする因子を世界で初めて明らかにした。まず、Gene Chipを用い(今回は12000種のマウス遺伝子について検索を行った。)、視床下部において約一日を周期として発現が変動する約100種類の遺伝子をまず明らかにした。これらの遺伝子の中で体内時計の夜(主観的夜と称する。)に活発に遺伝子が発現するものを選び、ゲノム配列を参照することによって、遺伝子の発現調節領域に10から11塩基の共通の遺伝子配列を見いだした。この配列にはRev-erbと呼ばれる因子が結合する。サーカディアンリズムを作り出す株化細胞系を用いることによって、この遺伝子配列が体内時計を動かすのに必須の配列であることを証明した

1.視交叉上核における体内時計乖離現象の発見と時差ボケの機序の解明:我々は急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の腹外側部と背内側部でPer1遺伝子が異なる時間帯に発現することを示した。 明期の開始時間を急に10時間遅らすと、ラットでも本来活動すべき暗期に、昼と同様の運動量が低下した時間が数日間にわたって生じる。すなわち、時差ボケがラットに生じたと考えられる。ここで、行動リズムとSCNの時計遺伝子の発現リズムの相関関係を検討した。新たな光周期に移った1日目からVL領域は再同調できたのにもかかわらず、光入力のないDM領域では、ゆっくりと一週間ほどかけて時計遺伝子の発現リズムは新たな光周期に同調していった。また、DM領域の再同調と行動リズムの再同調のパターンに強い相関関係を認めた。これはDMとVLの脱同調が時差ぼけの原因であることを示唆するものである。 2.視交叉上核における網羅的遺伝子採取と体内時計の夜に発現する遺伝子群に共通する転写応答配列の発見:マウスの視交叉上核から取り出したRNAを用いて体内時計の夜を形作る遺伝子群を解明し、それを、ごく最近明らかになってヒトのゲノム配列と照らし合わせることによって、体内時計の夜の時間を作るのに重要な働きをする因子を世界で初めて明らかにした。 3.トランスジェニックショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析:ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。また、mPer1を導入した系統と、mPer2を導入した系統では、その周期に優位な差が存在した。これは、Period遺伝子が種を越えて、同様の機能を持つことを示唆する。 4.cAMP分解酵素の阻害によるPer1遺伝子発現増強の試み:主観的夜における光照射による位相変位の大きさがPer1の発現量に比例することを我々は以前に報告している。また、cAMPによって、Per1の発現が誘導されることも知られている。これに伴い、cAMPの分解を進めるphosphodiesterase阻害薬を用いてPer1の発現量を増加させることが可能かを検討した。

視交叉上核におけるPer1遺伝子の誘導の限局性と時差ボケの機序の解明 夜間の光照射によってラットPer1は視交叉上核の腹外側部に発現し背内側部には誘導されなかった。Per1の誘導は位相変位のinitial stepと考えられており、このようにPer1遺伝子が限局した部位にのみ発現することは光反応性の時計と光には直接反応しない時計の2種類の体内時計が視交叉上核の中で乖離して存在することを示唆する。更に明瞭に2つの時計の存在を明らかにするため、急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の時計の位相をPer1の発現を指標として観察した。この際に背内側部の位相は明暗サイクルのシフト後にもとの位相からシフト後の位相に変位するのに約一週間を要しこれが時差ボケ現象の原因であると考えられた。 遺伝子導入ショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析 ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。 マウス時計遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析 Per1,Per2,Per3cDNAおよび、おのおのの遺伝子の上流の調節領域を採取し、そのプロモーター活性を測定した。これらのcDNAを発現ベクターに組み込み、エピトープタッグとしてFLAGを下流に結合し、株化細胞であるCOS7に発現させたところ、Western blottingにてタンパクの発現を検出できた。また、GFPにPer1,Per2,Per3を結合させて、その発現を観察した。これを用いてトランスジェニックマウスの作成段階に入っている。最近になり他施設よりPer1を過剰発現するトランスジェニックラットが作成された。今後、このようなラットに関しても時計遺伝子の発現の解析を行う予定である。また、TetracyclinによってPer1の発現が誘導される遺伝子導入動物の作成にも着手している。

脳内アロマテース含有ニューロンの中心は、雌雄で性的二型性を示し性分化の臨界期に一致して発現ピークを迎える内側視索前野一扁桃体弓(mPOAM)の膨大なアロマテース含有ニューロンにあることが示された。サルやヒトを含む霊長類でもこのエストロゲン合成ニューロンが同領域で証明され、ここで芳香化されたエストロゲンこそが哺乳動物脳の男性化や生殖機能の分化や誘導に中心的役割を果たすことが示された。このラットmPOAMにおいて、成獣雄ではアロマテースとアンドロゲン受容体の発現は強くエストロゲン受容体の発現は弱い。雌では逆にアロマテースとアンドロゲン受容体の発現が弱くエストロゲン受容体の発現が強いという結果が得られた。生直後の雌雄の去勢実験では、成獣雌ではアロマテース、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体の発現パターンに大きな変化は見られなかったが、雄ではアロマテースとアンドロゲン受容体の発現が減弱し、エストロゲン受容体の発現が増強するという雌性化パターンが見られた。さらに生直後に去勢された雄が性成熟レベルに達した後、3種の性ステロイドをそれぞれ投与した結果、ジヒドロテストステロン投与はアロマテースとアンドロゲン受容体の発現を増強させるがエストロゲン受容体の発現にはあまり影響がなく、エストロゲン投与はアロマテースとアンドロゲン受容体の発現をやや増強する一方エストロゲン受容体の発現を強く減弱させ、テストステロンの投与はアロマテースとアンドロゲン受容体の発現を増強させエストロゲン受容体の発現を減弱させる結果が得られた。以上の結果より、mPOAMに発現するアロマテース、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体は性ステロイドにより強い制御を受け雌雄における発現パターンが決定され、特にテストステロンから芳香化されたエストロゲンがエストロゲン受容体をdown regulationし脱女性化を賚し、非芳香化テストステロンはアンドロゲン受容体自身をup-regulationして男性化を誘導するというアロマテースの性ステロイド受容体制御による性分化機構が示唆された。