BACKGROUND: Current L1-based human papillomavirus (HPV) vaccines provide type-specific protection but offer limited cross-protection against non-vaccine HPV types. Therefore, developing a broad-spectrum HPV vaccine is highly desirable. METHODS: In this study, we optimized mRNA constructs and developed a multivalent L2-based mRNA vaccine encoding L2 aa 2-130, which includes all known neutralizing epitopes from four prevalent HPV types (HPV-6, -11, -16, and -18). We evaluated its immunogenicity in a mouse model and compared the efficacy of a commercially available mRNA delivery reagent with a custom-synthesized lipid nanoparticle (LNP) formulation. RESULTS: We identified that a construct containing E01 (a 5'-untranslated region) and SL2.7 (a poly(A) polymerase recruitment sequence) significantly increased protein expression. The L2-based mRNA vaccine induced robust and long-lasting humoral immune responses, with significant titers of cross-reactive serum IgG antibodies against L2 epitopes. Notably, the vaccine elicited cross-neutralizing antibodies and conferred cross-protective immunity not only against vaccine-targeted HPV types but also against non-vaccine HPV types, following intravaginal challenge in mice. We also found that LNP delivered mRNA more effectively in vivo. CONCLUSIONS: The L2-based mRNA vaccine developed in this study shows significant potential for broad-spectrum protection against multiple HPV types. This approach offers a promising strategy for reducing the global burden of HPV-associated cancers.

As aberrant accumulation of RNA-DNA hybrids (R-loops) causes DNA damage and genome instability, cells express regulators of R-loop structures. Here we report that RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) activity of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) regulates R-loop formation. We found that the phosphorylated form of hTERT (p-hTERT) exhibits RdRP activity in nuclear speckles both in telomerase-positive cells and telomerase-negative cells with alternative lengthening of telomeres (ALT) activity. The p-hTERT did not associate with telomerase RNA component in nuclear speckles but, instead, with TERRA RNAs to resolve R-loops. Targeting of the TERT gene in ALT cells ablated RdRP activity and impaired tumour growth. Using a genome-scale CRISPR loss-of-function screen, we identified Fanconi anaemia/BRCA genes as synthetic lethal partners of hTERT RdRP. Inactivation of RdRP and Fanconi anaemia/BRCA genes caused accumulation of R-loop structures and DNA damage. These findings indicate that RdRP activity of p-hTERT guards against genome instability by removing R-loop structures.

The renin-angiotensin system (RAS) plays a crucial role in the regulation of blood pressure. Activation of the angiotensin II (Ang II)-Ang II type 1 receptor (AT1R) signaling pathway contributes to the pathogenesis of hypertension and subsequent organ damage. AT1R-associated protein (ATRAP) has been identified as an endogenous inhibitory protein of the AT1R pathological activation. We have shown that mouse Atrap (Atrap) represses various Ang II-AT1R-mediated pathologies, including hypertension in mice. The expression of human ATRAP (ATRAP) /Atrap can be altered in various pathological states in humans and mice, such as Ang II stimulation and serum starvation. However, the regulatory mechanisms of ATRAP/Atrap are not yet fully elucidated. MicroRNAs (miRNAs) are 21-23 nucleotides of small RNAs which post-transcriptionally repress gene expression. Single miRNA can act on hundreds of target mRNAs, and numerous miRNAs have been identified as the Ang II-AT1R signaling-associated disease phenotype modulator, but nothing is known about the regulation of ATRAP/Atrap. In the present study, we identified miR-125a-5p and miR-125b-5p as the evolutionarily conserved miRNAs that potentially act on ATRAP/Atrap mRNA. Further analysis revealed that miR-125a-5p and miR-125b-5p can directly repress both ATRAP and Atrap. In addition, the inhibition of miR-125a-5p/miR-125b-5p resulted in the suppression of the Ang II-AT1R signaling in mouse distal convoluted tubule (mDCT) cells. Taken together, miR-125a-5p/miR-125b-5p activates Ang II-AT1R signaling by the suppression of ATRAP/Atrap. Our results provide new insights into the potential approaches for achieving the organ-protective effects by the repression of the miR-125 family associated with the enhancement of ATRAP/Atrap expression.

The progress in the research field of diabetic kidney disease (DKD) has been disturbed by the lack of reliable animal models. Angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R)-associated protein (ATRAP) promotes internalization of AT1R and selectively inhibits pathological AT1R signaling. In this study, we investigated whether overactivation of the renin-angiotensin system (RAS) through a combination of ATRAP deletion with Ang II stimulation developed a progressive DKD model in C57BL/6 mice, which are resistant to the development of kidney injury. Eight-week-old male systemic ATRAP-knockout mice on the C57BL/6 strain (KO) and their littermate wild-type mice (Ctrl) were divided into five groups: 1) Ctrl, 2) Ctrl-streptozotocin (STZ), 3) KO-STZ, 4) Ctrl-STZ-Ang II, and 5) KO-STZ-Ang II. Ang II was administered for 6 weeks from 4 weeks after STZ administration. At 10 weeks after STZ administration, mice were euthanized to evaluate kidney injuries. Neither ATRAP deletion alone nor Ang II stimulation alone developed a progressive DKD model in STZ-induced diabetic C57BL/6 mice. However, a combination of ATRAP deletion with Ang II stimulation accelerated the development of DKD as manifested by overt albuminuria, glomerular hypertrophy, podocyte loss, mesangial expansion, kidney interstitial fibrosis and functional insufficiency, concomitant with increased angiotensinogen and AT1R expression in the kidneys. In STZ-induced diabetic C57BL/6 mice that are resistant to the development of kidney injury, the combination of ATRAP deletion and Ang II stimulation accelerates the development of DKD, which may be associated with intrarenal RAS overactivation.

AIMS: Angiotensin receptor-neprilysin inhibitor (ARNI) is an established treatment for heart failure. However, whether ARNI has renoprotective effects beyond renin-angiotensin system inhibitors alone in cardiorenal syndrome (CRS) has not been fully elucidated. Here, we examined the effects of ARNI on the heart and kidneys of CRS model mice with overt albuminuria and identified the mechanisms underlying ARNI-induced kidney protection. METHODS AND RESULTS: C57BL6 mice were subjected to chronic angiotensin II infusion, nephrectomy, and salt loading (ANS); they developed CRS phenotypes and were divided into the vehicle treatment (ANS-vehicle), sacubitril/valsartan treatment (ANS-ARNI), and two different doses of valsartan treatment (ANS-VAL M, ANS-VAL H) groups. Four weeks after treatment, the hearts and kidneys of each group were evaluated. The ANS-vehicle group showed cardiac fibrosis, cardiac dysfunction, overt albuminuria, and kidney fibrosis. The ANS-ARNI group showed a reduction in cardiac fibrosis and cardiac dysfunction compared with the valsartan treatment groups. However, regarding the renoprotective effects characterized by albuminuria and fibrosis, ARNI was less effective than valsartan. Kidney transcriptomic analysis showed that the ANS-ARNI group exhibited a significant enhancement in the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-AKT signalling pathway compared with the ANS-VAL M group. Adding PI3K inhibitor treatment to ARNI ameliorated kidney injury to levels comparable with those of ANS-VAL M while preserving the superior cardioprotective effect of ARNI. CONCLUSION: PI3K pathway activation has been identified as a key mechanism affecting remnant kidney injury under ARNI treatment in CRS pathology, and blockading the PI3K pathway with simultaneous ARNI treatment is a potential therapeutic strategy for treating CRS with overt albuminuria.

BACKGROUND AND AIM: Dysregulation of angiotensin II type 1 receptor-associated protein (ATRAP) expression in cardiovascular, kidney, and adipose tissues is involved in the pathology of hypertension, cardiac hypertrophy, atherosclerosis, kidney injury, and metabolic disorders. Furthermore, ATRAP is highly expressed in bone marrow-derived immune cells; however, the functional role of immune cell ATRAP in obesity-related pathology remains unclear. Thus, we sought to identify the pathophysiological significance of immune cell ATRAP in the development of visceral obesity and obesity-related metabolic disorders using a mouse model of diet-induced obesity. METHODS: Initially, we examined the effect of high-fat diet (HFD)-induced obesity on the expression of immune cell ATRAP in wild-type mice. Subsequently, we conducted bone marrow transplantation to generate two types of chimeric mice: bone marrow wild-type chimeric (BM-WT) and bone marrow ATRAP knockout chimeric (BM-KO) mice. These chimeric mice were provided an HFD to induce visceral obesity, and then the effects of immune cell ATRAP deficiency on physiological parameters and adipose tissue in the chimeric mice were investigated. RESULTS: In wild-type mice, body weight increase by HFD was associated with increased expression of immune cell ATRAP. In the bone marrow transplantation experiments, BM-KO mice exhibited amelioration of HFD-induced weight gain and visceral fat expansion with small adipocytes compared BM-WT mice. In addition, BM-KO mice on the HFD showed significant improvements in white adipose tissue metabolism, inflammation, glucose tolerance, and insulin resistance, compared with BM-WT mice on the HFD. Detailed analysis of white adipose tissue revealed significant suppression of HFD-induced activation of transforming growth factor-beta signaling, a key contributor to visceral obesity, via amelioration of CD206+ macrophage accumulation in the adipose tissue of BM-KO mice. This finding suggests a relevant mechanism for the anti-obesity phenotype in BM-KO mice on the HFD. Finally, transcriptome analysis of monocytes indicated the possibility of genetic changes, such as the enhancement of interferon-γ response at the monocyte level, affecting macrophage differentiation in BM-KO mice. CONCLUSION: Collectively, our results indicate that ATRAP in bone marrow-derived immune cells plays a role in the pathogenesis of visceral obesity. The regulation of ATRAP expression in immune cells may be a key factor against visceral adipose obesity with metabolic disorders.

Regulation of gene expression in response to various biological processes, including extracellular stimulation and environmental adaptation requires nascent RNA synthesis and translation. Analysis of the coordinated regulation of dynamic RNA synthesis and translation is required to determine functional protein production. However, reliable methods for the simultaneous measurement of nascent RNA synthesis and translation at the gene level are limited. Here, we developed a novel method for the simultaneous assessment of nascent RNA synthesis and translation by combining 4-thiouridine (4sU) metabolic RNA labeling and translating ribosome affinity purification (TRAP) using a monoclonal antibody against evolutionarily conserved ribosomal P-stalk proteins. The P-stalk-mediated TRAP (P-TRAP) technique recovered endogenous translating ribosomes, allowing easy translatome analysis of various eukaryotes. We validated this method in mammalian cells by demonstrating that acute unfolded protein response (UPR) in the endoplasmic reticulum (ER) induces dynamic reprogramming of nascent RNA synthesis and translation. Our nascent P-TRAP (nP-TRAP) method may serve as a simple and powerful tool for analyzing the coordinated regulation of transcription and translation of individual genes in various eukaryotes.

Considering the prevalence of obesity and global aging, the consumption of a high-protein diet (HPD) may be advantageous. However, an HPD aggravates kidney dysfunction in patients with chronic kidney disease (CKD). Moreover, the effects of an HPD on kidney function in healthy individuals are controversial. In this study, we employed a remnant kidney mouse model as a CKD model and aimed to evaluate the effects of an HPD on kidney injury under conditions of non-CKD and CKD. Mice were divided into four groups: a sham surgery (sham) + normal diet (ND) group, a sham + HPD group, a 5/6 nephrectomy (Nx) + ND group and a 5/6 Nx + HPD group. Blood pressure, kidney function and kidney tissue injury were compared after 12 weeks of diet loading among the four groups. The 5/6 Nx groups displayed blood pressure elevation, kidney function decline, glomerular injury and tubular injury compared with the sham groups. Furthermore, an HPD exacerbated glomerular injury only in the 5/6 Nx group; however, an HPD did not cause kidney injury in the sham group. Clinical application of these results suggests that patients with CKD should follow a protein-restricted diet to prevent the exacerbation of kidney injury, while healthy individuals can maintain an HPD without worrying about the adverse effects.

Abstract Protein phosphorylation is one of the most widespread post-translational modifications in biology^1,2. With advances in mass-spectrometry-based phosphoproteomics, 90,000 sites of serine and threonine phosphorylation have so far been identified, and several thousand have been associated with human diseases and biological processes^3,4. For the vast majority of phosphorylation events, it is not yet known which of the more than 300 protein serine/threonine (Ser/Thr) kinases encoded in the human genome are responsible³. Here we used synthetic peptide libraries to profile the substrate sequence specificity of 303 Ser/Thr kinases, comprising more than 84% of those predicted to be active in humans. Viewed in its entirety, the substrate specificity of the kinome was substantially more diverse than expected and was driven extensively by negative selectivity. We used our kinome-wide dataset to computationally annotate and identify the kinases capable of phosphorylating every reported phosphorylation site in the human Ser/Thr phosphoproteome. For the small minority of phosphosites for which the putative protein kinases involved have been previously reported, our predictions were in excellent agreement. When this approach was applied to examine the signalling response of tissues and cell lines to hormones, growth factors, targeted inhibitors and environmental or genetic perturbations, it revealed unexpected insights into pathway complexity and compensation. Overall, these studies reveal the intrinsic substrate specificity of the human Ser/Thr kinome, illuminate cellular signalling responses and provide a resource to link phosphorylation events to biological pathways.

Kidney fibrosis is a common pathway that leads to chronic kidney disease. Angiotensin II type-1 receptor (AT1R)-associated protein (ATRAP) was originally identified as an AT1R-binding protein. Previously, we reported that systemic knockout of ATRAP exacerbates kidney fibrosis in aged mice. Although these effects of ATRAP appeared to be AT1R-independent actions, the molecular mechanism remains poorly understood. To elucidate the molecular mechanism of ATRAP independent of AT1R, we explored novel ATRAP-interacting proteins. Mass spectrometric analysis of the immunoprecipitants of a Flag-tagged ATRAP complex revealed 376 candidate proteins that potentially interact with ATRAP. Gene ontology analysis revealed that proteins related to vesicle trafficking, membrane transport, and many membrane proteins, including transferrin receptor 1 (TfR1), were enriched. Because TfR1 promotes cellular iron uptake and iron is a key factor involved in kidney fibrosis, we focused on TfR1 and confirmed that it interacts with ATRAP. In addition, our findings revealed that enhanced ATRAP expression decreased cell-surface TfR1 expression without altering the overall cellular TfR1 expression levels. Furthermore, enhanced ATRAP expression attenuated cellular iron levels. Together, our results highlight the role of ATRAP as a suppressor of TfR1 that functions by facilitating TfR1 internalization, which affects iron metabolism and oxidative stress signaling.

Although activation of the renin-angiotensin system and of its glomerular components is implicated in the pathogenesis of diabetic nephropathy, the functional roles of the tubular renin-angiotensin system with AT1 receptor signaling in diabetic nephropathy are unclear. Tissue hyperactivity of the renin-angiotensin system is inhibited by the angiotensin II type 1 receptor-associated protein ATRAP, which negatively regulates receptor signaling. The highest expression of endogenous ATRAP occurs in the kidney, where it is mainly expressed by tubules but rarely in glomeruli. Here, we found that hyperactivation of angiotensin II type 1 receptor signaling in kidney tubules exacerbated diabetic glomerular injury in a mouse model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy. These phenomena were accompanied by decreased expression of CD206, a marker of alternatively activated and tissue-reparative M2 macrophages, in the kidney tubulointerstitium. Additionally, adoptive transfer of M2- polarized macrophages into diabetic ATRAP-knockout mice ameliorated the glomerular injury. As a possible mechanism, the glomerular mRNA levels of tumor necrosis factor-α and oxidative stress components were increased in diabetic knockout mice compared to non-diabetic knockout mice, but these increases were ameliorated by adoptive transfer. Furthermore, proximal tubule-specific ATRAP downregulation reduced tubulointerstitial expression of CD206, the marker of M2 macrophages in diabetic mice. Thus, our findings indicate that tubular ATRAP-mediated functional modulation of angiotensin II type 1 receptor signaling modulates the accumulation of tubulointerstitial M2 macrophages, thus affecting glomerular manifestations of diabetic nephropathy via tubule-glomerular crosstalk.

Tumor necrosis factor (TNF)-α is a potent mediator of inflammation and is involved in the pathophysiology of chronic kidney disease (CKD). However, the effects of TNF-α inhibition on the progression of kidney fibrosis have not been fully elucidated. We examined the effects of TNF-α inhibition by etanercept (ETN) on kidney inflammation and fibrosis in mice with aristolochic acid (AA) nephropathy as a model of kidney fibrosis. C57BL/6 J mice were administered AA for 4 weeks, followed by a 4-week remodeling period. The mice exhibited kidney fibrosis, functional decline, and albuminuria concomitant with increases in renal mRNA expression of inflammation- and fibrosis-related genes. The 8-week ETN treatment partially but significantly attenuated kidney fibrosis and ameliorated albuminuria without affecting kidney function. These findings were accompanied by significant suppression of interleukin (IL)-1β, IL-6, and collagen types I and III mRNA expression. Moreover, ETN tended to reduce the AA-induced increase in interstitial TUNEL-positive cells with a significant reduction in Bax mRNA expression. Renal phosphorylated p38 MAPK was significantly upregulated by AA but was normalized by ETN. These findings indicate a substantial role for the TNF-α pathway in the pathogenesis of kidney fibrosis and suggest that TNF-α inhibition could become an adjunct therapeutic strategy for CKD with fibrosis.

The kidney is one of the most susceptible organs to age-related impairments. Generally, renal aging is accompanied by renal fibrosis, which is the final common pathway of chronic kidney diseases. Aristolochic acid (AA), a nephrotoxic agent, causes AA nephropathy (AAN), which is characterized by progressive renal fibrosis and functional decline. Although renal fibrosis is associated with renal aging, whether AA induces renal aging remains unclear. The aim of the present study is to investigate the potential use of AAN as a model of renal aging. Here, we examined senescence-related factors in AAN models by chronically administering AA to C57BL/6 mice. Compared with controls, the AA group demonstrated aging kidney phenotypes, such as renal atrophy, renal functional decline, and tubulointerstitial fibrosis. Additionally, AA promoted cellular senescence specifically in the kidneys, and increased renal p16 mRNA expression and senescence-associated β-galactosidase activity. Furthermore, AA-treated mice exhibited proximal tubular mitochondrial abnormalities, as well as reactive oxygen species accumulation. Klotho, an antiaging gene, was also significantly decreased in the kidneys of AA-treated mice. Collectively, the results of the present study indicate that AA alters senescence-related factors, and that renal fibrosis is closely related to renal aging.

The mammalian cell nucleus is a highly organized organelle that contains membrane-less structures referred to as nuclear bodies (NBs). Some NBs carry specific RNA types that play architectural roles in their formation. Here, we show two types of RNase-sensitive DBC1-containing NBs, DBC1 nuclear body (DNB) in HCT116 cells and Sam68 nuclear body (SNB) in HeLa cells, that exhibit phase-separated features and are constructed using RNA polymerase I or II transcripts in a cell type-specific manner. We identified additional protein components present in DNB by immunoprecipitation-mass spectrometry, some of which (DBC1 and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L [HNRNPL]) are required for DNB formation. The rescue experiment using the truncated HNRNPL mutants revealed that two RNA-binding domains and intrinsically disordered regions of HNRNPL play significant roles in DNB formation. All these domains of HNRNPL promote in vitro droplet formation, suggesting the need for multivalent interactions between HNRNPL and RNA as well as proteins in DNB formation.

Elevated angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) expression in organs that are potential targets of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 may increase the risk of coronavirus disease 2019 (COVID-19) infection. Previous reports show that ACE2 alter its tissue-specific expression patterns under various pathological conditions, including renal diseases. Here, we examined changes in pulmonary ACE2 expression in two mouse chronic kidney disease (CKD) models: adenine-induced (adenine mice) and aristolochic acid-induced (AA mice). We also investigated changes in pulmonary ACE2 expression due to renin-angiotensin system (RAS) blocker (olmesartan) treatment in these mice. Adenine mice showed significant renal functional decline and elevated blood pressure, compared with controls. AA mice also showed significant renal functional decline, compared with vehicles; blood pressure did not differ between groups. Renal ACE2 expression was significantly reduced in adenine mice and AA mice; pulmonary expression was unaffected. Olmesartan attenuated urinary albumin excretion in adenine mice, but did not affect renal or pulmonary ACE2 expression levels. The results suggest that the risk of COVID-19 infection may not be elevated in patients with CKD because of their stable pulmonary ACE2 expression. Moreover, RAS blockers can be used safely in treatment of COVID-19 patients with CKD.

Polymicrogyria is a common malformation of cortical development whose etiology remains elusive. We conducted whole-exome sequencing for 124 patients with polymicrogyria and identified de novo ATP1A3 variants in eight patients. Mutated ATP1A3 causes functional brain diseases, including alternating hemiplegia of childhood (AHC), rapid-onset dystonia parkinsonism (RDP), and cerebellar ataxia, areflexia, pes cavus, optic nerve atrophy, and sensorineural deafness (CAPOS). However, our patients showed no clinical features of AHC, RDP, or CAPOS and had a completely different phenotype: a severe form of polymicrogyria with epilepsy and developmental delay. Detected variants had different locations in ATP1A3 and different functional properties compared with AHC-, RDP-, or CAPOS-associated variants. In the developing cerebral cortex of mice, radial neuronal migration was impaired in neurons overexpressing the ATP1A3 variant of the most severe patients, suggesting that this variant is involved in cortical malformation pathogenesis. We propose a previously unidentified category of polymicrogyria associated with ATP1A3 abnormalities.

Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has developed into a global pandemic since its first outbreak in the winter of 2019. An extensive investigation of SARS-CoV-2 is critical for disease control. Various recombinant monoclonal antibodies of human origin that neutralize SARS-CoV-2 infection have been isolated from convalescent patients and will be applied as therapies and prophylaxis. However, the need for dedicated monoclonal antibodies suitable for molecular pathology research is not fully addressed. Here, we produced six mouse anti-SARS-CoV-2 spike monoclonal antibodies that exhibit not only robust performance in immunoassays including western blotting, ELISA, immunofluorescence, and immunoprecipitation, but also demonstrate neutralizing activity against SARS-CoV-2 infection to VeroE6/TMPRSS2 cells. Due to their mouse origin, our monoclonal antibodies are compatible with the experimental immunoassay setups commonly used in basic molecular biology research laboratories, providing a useful tool for future research. Furthermore, in the hope of applying the antibodies of clinical setting, we determined the variable regions of the antibodies and used them to produce recombinant human/mouse chimeric antibodies.

The threat of the current coronavirus disease pandemic, caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), is accelerating the development of potential vaccines. Candidate vaccines have been generated using existing technologies that have been applied for developing vaccines against other infectious diseases. Two new types of platforms, mRNA- and viral vector-based vaccines, have been gaining attention owing to the rapid advancement in their methodologies. In clinical trials, setting appropriate immunological endpoints plays a key role in evaluating the efficacy and safety of candidate vaccines. Updated information about immunological features from individuals who have or have not been exposed to SARS-CoV-2 continues to guide effective vaccine development strategies. This review highlights key strategies for generating candidate SARS-CoV-2 vaccines and considerations for vaccine development and clinical trials.

Oncoprotein E6 of high-risk human papillomavirus (HPV) plays a critical role in inducing cell immortalization and malignancy. E6 downregulates caspase-dependent pathway through the degradation of p53. However, the effect of HPV E6 on other pathways is still under investigation. In the present study, we found that HPV E6 directly binds to all three forms (precursor, mature, and apoptotic) of apoptosis-inducing factor (AIF) and co-localizes with apoptotic AIF. This binding induced MG132-sensitive reduction of AIF expression in the presence of E6 derived from HPV16 (16E6), a cancer-causing type of HPV. Conversely, E6 derived from a non-cancer-causing type of HPV, HPV6 (6E6), did not reduce the levels of AIF despite its interaction with AIF. Flow cytometric analysis revealed that 16E6, but not 6E6, suppressed apoptotic AIF-induced chromatin degradation (an indicator of caspase-independent apoptosis) and staurosporine (STS, a protein kinase inhibitor)-induced apoptosis. AIF knockdown reduced STS-induced apoptosis in both of 16E6-expressing and 6E6-expressing cells; however, the reduction in 16E6-expressing cells was lower than that in 6E6-expressing cells. These findings indicate that 16E6, but not 6E6, blocks AIF-mediated apoptosis, and that AIF may represent a novel therapeutic target for HPV-induced cervical cancer.

Epithelial cells establish apicobasal polarity by forming tight junctions (TJs) at the apical-lateral boundary, which play fundamental roles in physiological functions. An evolutionarily conserved atypical protein kinase C (aPKC)-partitioning defective (PAR) complex functions as a platform for TJ assembly during cell polarity establishment. However, how this complex converts the spatial cues into a subsequent active unit is unclear. Here, we identify an epithelial isoform of Shank2 as a mediator of the aPKC-PAR complex. Shank2 binds to and colocalizes with aPKC at apical junctional regions of polarized epithelial cells. Shank2 knockdown results in defects in TJ formation. Mechanistically, we find that the N-terminal SPN domain is required for the junctional localization of Shank2 and binds to the active form of Rap1 small GTPase, which is involved in TJ formation. Our findings suggest that a close physical and functional relationship between aPKC and Shank2-active Rap1 signaling serves as the platform for TJ assembly to regulate epithelial cell polarity.

Chronic kidney disease (CKD) progresses to end-stage renal failure via renal tubulointerstitial fibrosis. Malnutrition, inflammation, and arteriosclerosis interact to exacerbate the poor prognosis of CKD, and their effective management is thus essential. The traditional Japanese medicine Rikkunshito (RKT) exerts appetite-stimulating effects via ghrelin, which attenuates inflammation and fibrosis. We evaluated the therapeutic effect of RKT in unilateral ureter obstruction (UUO)-induced renal fibrosis/inflammation and body weight loss in mice. UUO and sham-operated mice were fed a standard diet or diet containing 3.0% RKT. Renal fibrosis was investigated by histopathology and macrophage infiltration was determined by immunohistochemistry. Expression levels of genes associated with fibrosis, inflammation, ghrelin, and mitochondrial function were determined by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot analyses. RKT treatment partially prevented UUO-induced weight loss but failed to attenuate renal fibrosis and inflammation. Renal expression of sirtuin 1, a ghrelin-downstream signalling molecule, and gene expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α and Bcl-2/adenovirus E1B interacting protein 3 were unaffected by RKT. These results indicate that RKT inhibits weight loss but does not improve renal fibrosis or inflammation in a rapidly progressive renal fibrosis mouse model. RKT may have a protective effect on weight loss associated with CKD.

The proximal tubule is a particularly important site for ageing-related kidney damage. Sirtuin 1 (SIRT1), an NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide)-dependent deacetylase in the proximal tubule, may be involved in renal injury associated with ageing. However, the mechanisms of SIRT1 regulation remain to be elucidated. We recently reported that angiotensin II type 1 receptor (AT1R)-associated protein (ATRAP)-deficient mice displayed age-associated renal function decline and tubulointerstitial fibrosis. Our data showed that SIRT1 protein expression was reduced in ATRAP-deficient mice, although the relationship between ATRAP deficiency and age-associated renal fibrosis is still not fully understood. It is, therefore, necessary to investigate how ATRAP affects SIRT1 protein expression to resolve ageing-associated kidney dysfunction. Here, since ageing studies are inherently lengthy, we used an ex vivo model of the proximal tubule to determine the role of ATRAP in SIRT1 protein expression. We first generated a clonal immortalised human renal proximal tubule epithelial cell line (ciRPTEC) expressing AT1R and ATRAP. Using this cell line, we demonstrated that ATRAP knockdown reduced SIRT1 protein expression in the ciRPTEC but did not alter SIRT1 mRNA expression. Thus, ATRAP likely mediates SIRT1 protein abundance in ciRPTEC.

がん免疫を賦活化する方法として、mRNA監視機構を抑制により、がん細胞に特異的ながん抗原の元となる異常タンパク質を強制発現させる手法の可能性が指摘されている。本研究では、mRNA監視機構を阻害する新たな手法の開発に向けて、mRNA監視機構の新規の阻害因子の同定と解析を目的とした。免疫チェックポイント阻害 による治療の根幹となる、がん抗原の主体がフレームシフト 異遺伝子由 のmRNAがコードする非天然ペプチドであることが分かってきた。フレームシフト 異が生じると、すぐに異常終止コドンが出現し、mRNA監視機構によりmRNAが分解され、がん抗原の発現は低く抑えられている。そのため、がん抗原の発現促進によるがん免疫賦活化にはmRNA監視機構の阻害が重要となる。本研究は、細胞ストレスなどにより、mRNA監視機構を抑制し、がん抗原を発現させる手法の開発につながる基盤となるものである。本研究では、我々が開発したシーズ技術である 高精度mRNA監視機構モニタリングシステム（特許出願中）を用い」研究を実施した。 具体的には以下の二つの研究を推進している。 1） ストレス 答依存的なmRNA監視機構阻害因子の同定と解析：①独自の細胞ストレスに応答したリボソーム結合RNAの次世代シークエンス解析データ（約200遺伝子）と既報のリボソームフットプリント解析データ（約800遺伝子）を合わせストレス依存的に翻訳が促進する遺伝子の中から共通する物を約４０遺伝子抽出した。これについてそれぞれ２種のsiRNAを合成し、②独自の高精度mRNA監視機構モニタリングシステムを用いた解析により、４つまで候補遺伝子のを絞り込むことに成功した。これらについて、cDNA入手と発現ベクターの構築を進めている。さらに、独自のリボソーム結合RNA同定プロトコールの樹立を進めており、今後の解析の迅速化を図っている。

遺伝性疾患やがんにおける変異の約三分の一において、結果的に異常な終止コドンが生じる。異常終止コドンを有するmRNAは異常なタンパク質をコードするが、生体が有するmRNA監視機構のひとつであるNMD (nonsense-mediated mRNA decay)により積極的に分解排除されることにより、その発現が抑制される。申請者らを含む研究により異常mRNAの認識と分解の機構については大きく理解が深まった。一方で、変異mRNA由来の新生タンパク質の運命やNMD活性制御についてはほとんど分かっていない。本研究では、研究代表者がこれまでに多面的に研究を進めてきたNMD分子機構解析やNMD制御因子の新規結合タンパク質に着目し、『1) NMD制御因子の新規結合タンパク質を足がかりとした、NMDにおける異常終止コドン識別複合体形成と新生タンパク質解離・リボソーム解離の分子機の解明、2) NMD制御因子の新機能を足がかりとした、細胞ストレスがポスト異常終止コドン識別イベントに与える影響の解明』を行う。これらの解析により、NMDを標的とした革新的新規遺伝性疾患・”がん抗原となり得る変異mRNA由来の新生タンパク質発現”によるがん治療開発へ向けた基盤を確立すべく研究を行った。具体的には、細胞内在性リボソームに対する抗体を用いたTranslating Ribosome Affinity Purification (TRAP)-seq解析と新規合成RNA標識を組み合わせた改正既報の樹立を行った。さらに、構成的プロテアソーム構成因子と免疫プロテアソーム構成因子の比較を進めた。

老化加速病態である糖尿病において、尿細管におけるATRAPが、尿細管局所でのサイトカイン環境を調節し、M2マクロファージの発現制御を介して、糖尿病糸球体障害を抑制する可能性を明らかにした。最初に、野生型マウスを用いて、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病を惹起させると、腎尿細管のATRAP発現の減少ともに、腎アンジオテンシノーゲンの発現増加を認め、腎レニン－アンジオテンシン（RA）系の活性化が示唆された。次に野生型マウスと全身性ATRAPノックアウトにストレプトゾトシン誘発性糖尿病を起こし、腎臓の変化を観察した。その結果、糖尿病ATRAPノックアウトマウスでは、血圧や血糖値などは糖尿病野生型マウスと同等であったが、尿細管RA系の活性はより亢進しており、糖尿病性腎症の糸球体障害（アルブミン尿、糸球体腫大、足細胞の脱落など）の増悪とともに尿細管間質でのIL-13の発現低下とM2マクロファージの減少を認めた。この現象は、近位尿細管特異的ATRAPノックアウトマウスでも観察された。そこで、マウスの骨髄から抽出して培養したM2マクロファージを糖尿病ATRAPノックアウトマウスに投与したところ、野生型糖尿病マウスと同程度まで糖尿病性腎症の糸球体障害が改善した。さらに、糸球体遺伝子発現解析の結果、尿細管でのM2マクロファージが、糸球体でのTNF-α、酸化ストレスを抑制して糖尿病性糸球体障害を抑制する可能性が示唆された。以上より、糖尿病性腎症に対するレニン‐アンジオテンシン（R-A）系阻害薬の腎保護効果の新たなメカニズムとして、腎尿細管RA系の過剰な活性化が糸球体障害を増悪させるという腎尿細管－糸球体連関の存在が示唆された。すなわち、尿細管ATRAPは糖尿病性腎症の新たな治療標的となる可能性がある。本研究成果はKidney International誌に報告された。

ヒトパピローマウイルス（HPV）は子宮頸がんの原因ウイルスである。現在のワクチンは子宮頸がんに対する完全な予防ができていない。また、治療薬も開発されていない。そのため、次世代のHPVに対する治療・予防法が求められている。本研究計画では、以下の3つの方法を用いてHPV感染に関わる細胞因子の網羅的探索を行う。 1.HPV感染における新規同定された細胞受容体候補であるHPV-BP1の役割を詳細に解析することにより、HPVの感染過程の解明を行う。更に、HPV-BP1に対する中和抗体の作製によりHPV感染の予防法の開発を試みる。 2.タグ付きHPV遺伝子産物を細胞に導入し、質量分析法でHPVと結合する細胞因子を網羅的に同定、解析することによりHPVの感染過程、特に発がんメカニズムを解明し、HPV感染の治療法を検討する。 3.CRISPR/Cas9ゲノム編集技術によるHPV感染に関わる必須な細胞因子を同定し、HPV感染に対する次世代治療・予防法の開発を検討する。

今年度の研究では、クローン化不死化ヒト近位尿細管細胞株(ciRPTEC)の樹立を行い，in vitroでATRAPによるSIRT1発現調節機構を解析し、近位尿細管におけるATRAPの腎性老化に関わる機序について検討した。本研究における解析で、ciRPTECにおける一過性のATRAP発現低下がAng II刺激なしにSRIT1タンパク質の発現量を低下させることを明らかにした。本結果から、近位尿細管においてATRAPがAng II-AT1Rシグナル伝達経路と非依存的にSIRT 1タンパク質の発現を調節していることが示唆された。一方、ATRAPのノックダウンや欠損はSIRT1 mRNAの発現を変化させなかった。ciRPTECにおいて、SIRT1タンパク質の発現は、SIRT1 mRNAの発現と必ずしも一致せず、血清飢餓によってSIRT1 mRNA蓄積を誘導したとしてもSIRT1タンパク質の発現は変化しなかった。このことは、ciRPTECにおけるSIRT1タンパク質の存在量が、主にタンパク質新規合成または安定性のレベルで調節され、mRNA転写または安定性のレベルでは調節されないことを示すものであると考えられる。 SIRT1は、加齢に伴う慢性腎臓病の病因に関与する分子であり、様々な機序を介して腎臓をはじめ、臓器保護的に働くタンパクである。今回の研究は加齢に伴う腎臓の線維化にATRAPの関与を示した我々の以前の報告と合わせて、ATRAPがSIRT1タンパク質発現を調節し、加齢に伴う慢性腎臓病の発症機序にどのように関与しているかのメカニズム解析の一助になると考える。今後は近位尿細管ATRAPの新規結合タンパクの取得や発現・活性調節機序により焦点を当てて、培養細胞系や動物実験系を含めての多面的な解析を推進していく予定である。

遺伝性疾患における変異のうち、全体の約三分の一において異常な終止コドンを生じる。このような変異遺伝子由来mRNAは品質管理機構であるNMDにより分解排除される。この異常終止コドンを有するmRNA由来のタンパク質が機能を有する症例由来の細胞では、mRNA監視機構阻害は細胞機能回復へつながることをこれまでに明らかとしてきた。 Cystic Fibrosisやデュシャンヌ型筋ジストロ フィーを初めとする遺伝子変異の10%を占める点変異による異常終止コドンについては、終止コドンリードスルー剤の開発が進められているが、リードスルー剤はNMDをほとんど阻害しないため、これにmRNA監視機構阻害を組み合わせることで相乗効果があることも期待される。このような状況の中、近年、転写制御レポーターアッセイを元にしたNMD阻害薬スクリーニングの報告が相次いでいる。しかし、NMD阻害活性を追試できない「擬陽性」が含まれていることが大きなボトルネックとなっており、真のNMD阻害剤が待ち望まれている。 一方、NMD阻害による疾患症状回復の可能性をテストする動物モデルはこれまで存在しなかった。また、リードスルー剤による症状回復モデルマウスは樹立されているが、その全てがトランスジェニックマウスであり、多コピーのトランスジンが発現している。そのため、実際の遺伝性疾患におけるシングルコピーの遺伝子での治療効果を必ずしも反映していない。 昨年度までに、CFTR cDNAの入手を行い、発現ベクターの構築を進めると共に、動物実験計画を策定し、CFTR W1278Xマウスの準備を進めた。

AT1受容体結合性低分子蛋白(AT1 receptor-associated protein; ATRAP)は，『慢性的な病的刺激の持続によるAT1受容体情報伝達系の過剰活性化に拮抗する内在性抑制分子』である可能性がある．本研究では，ATRAPの発現・活性調節機構異常と老化に伴う心血管病との関連について多面的に検討し，ATRAP の老化関連心血管病における病態生理学的意義の解明，および ATRAP に着目した新規分子標的治療法の開発に向けた検討を行った．その結果，ATRAPは腎老化・個体寿命に対して保護的に作用し，その機序はアンジオテンシン非依存性でSirt1を介している可能性が示唆された．

本研究では、1) BP-1は細胞の表面に発現し、HPVと結合及び共局在している。BP-1が欠損されると細胞へのHPV感染が有意に低下した。2)高リスクHPV E6がAIFに結合し、AIFの分解によってAIFが誘発したクロマチン分解を阻害する。E6 は AIF の FAD ドメインに結合し、AIF と共局在する。AIF欠損では、16E6発現細胞がSTS誘発アポトーシスを減少させた。これらの知見は、HPV BP-1がHPV受容体候補であり、高リスクE6はAIFを介してアポトーシスを抑制し、AIFが子宮頸癌の新しい治療標的を表す可能性があることを示している。

ヒトの遺伝性疾患における変異のうち、全体の約三分の一において異常な終止コドンを生じる。このような変異遺伝子由来mRNAは品質管理機構であるNMDにより分解排除される。この異常終止コドンを有するmRNA由来のタンパク質が機能を有する症例では、mRNA監視機構阻害は疾患症状回復へつながることをこれまでに明らかとしてきた。本研究では、独自に樹立した高感度・高精度のmRNA監視機構評価システムの改良に成功した。さらに、in vivoにおけるNMD抑制依存的な遺伝性疾患の症状回復モデルとして、 不死化Ullrich disease患者由来細胞と嚢胞性線維症PTCマウスの樹立に成功した。

生物は栄養が不足した際に、消費を抑えて、飢餓による細胞死を防ぐ仕組みを持つ。こうした仕組みは出芽酵母からヒトを含む高等動物にまで共通であり、mTORC1 不活性化とGCN2 活性化により翻訳が抑制される。しかし、哺乳動物におけるGCN2活性化機構や飢餓アミノ酸をコードするコドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖の運命についてはほとんど解析が進んでいない。本研究では、アミノ酸飢餓時に飢餓アミノ酸コドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するレポーターを新たに作成し、mTORC1やGCN2などのシグナル経路と新生鎖の運命の関わりの解明を目指した。 GCN2制御機構の解析においては、GCN2の活性を制御する新規因子を同定し、分子機構の解明に成功した。一方、当初計画していたNanoLucを用いたレポーターにおいて、全リジンのアルギニンへの変異、全アルギニンのリジンへの変異に成功した。しかし、それ以外のアミノ酸変異では、十分なNanoLuc活性が得られなかった。そこで、NanoLucのSplit peptideであるHiBitを改変したmHiBit を樹立し、安定なT4 Lysozymeと融合させたレポーターを構築した。また、ribosomeの簡易精製のためのeGFP-rpS10a融合タンパク質を安定発現する細胞株を樹立し、ribosomeに結合するmRNAを解析する方法についても導入を進め、次世代シークエンス解析により、ロイシン飢餓依存的翻訳変動を解析した。その結果、4時間のロイシン飢餓では、mRNAについてribosomeとの結合に変化が生じず、uORFを有する遺伝子を含む、一部のmRNAについてのみリボソームとの結合が上昇することが明らかになった。ロイシン以外の様々なアミノ酸について、1種類の飢餓では、翻訳抑制が起きていないことをレポーターを用いた解析により明らかとした。

本研究により、ナンセンス変異を有するmRNAからの異常タンパク質の発現を防ぐmRNA監視機構-NMD(Nonsense-mediated mRNA decay)の異常終止コドン複合体初期形成機構の詳細明らかとした。また、SMG1が関わる新たなストレス応答機構について解析を進め、酸化ストレス依存的にSMG1が活性化すること、SMG1が酸化ストレスの中心分子として機能する転写因子NRF2依存的なHO-1発現に必須な役割を果たすことを明らかにした。さらに、SMG1がNRF2を直接リン酸化すること、そのリン酸化部位の同定に成功し、SMG1によるNRF2活性制御機構の解明を進めている。

本研究期間中、（１）我々は高力価のHPV偽粒子作成に成功した。そのHPVの偽粒子を使用し、HPVが細胞感染に関わる細胞膜分子であるBP-1を同定した。（２）新規細胞分子であるp55がE6とE7の両方に結合することが確認された。Ｅ6とp55が細胞内で共局在していることも確認された。Ｅ6はp55をユビキチン化によって分解し、また、細胞がアアポトーシスに対する感受性はp55の発現量に影響された。P55はHPV感染による子宮頸がんの新たな治療ターゲットになると考えられる。

環境ストレス、小胞体ストレスプレコンディショニングによりmRNA監視機構NMDは抑制され、早期終止コドンPTCを有する疾患遺伝子がコードする蛋白質が発現した。NMD抑制は、eukaryotic initiation factor 2αのリン酸化による翻訳抑制とNMD構成因子の発現抑制によって生じた。環境ストレスは、PTCを有する疾患細胞の表現型に影響を及ぼす因子となりうる。

本研究により、ナンセンス変異を有するmRNAからの異常タンパク質の発現を防ぐmRNA監視機構-NMD(Nonsense-mediated mRNA decay)の分子機構の詳細明らかとした。さらに、NMD制御因子のうち、SMG-8の活性阻害は細胞毒性を示さないことを示し、NMD阻害による遺伝性疾患治療が現実的であることを明らかとした。また、NMDの生理的基質のうちATF4について、その発現調節がmRNA量よりも翻訳調節による寄与が大きいことを示した。これらの成果により、NMDによる遺伝子発現制御の実態解明を進めることに成功した。

小分子RNAとは約20塩基程度の小さなRNAであり、RNAサイレンシングあるいはRNA interference (RNA干渉)と呼ばれる現象によって、遺伝子発現を抑制する。RNAサイレンシングは、神経機能などの高次生命機能を制御したり、癌化などの重篤な疾病に関わることがわかっている。本研究では、小分子RNA作用マシナリーの調節機構を塩基対合の様式や、相互作用するRNA結合タンパク質との相互作用から解析した。

H21～25年度の新学術領域研究「非コードRNA作用マシナリー」領域からは非コードRNA動作原理に関する優れた研究成果が多数生み出され、本領域はホームページや雑誌企画、ワークショップ、一般向けのプレスリリースなど、外部に対して積極的に情報を発信し、得られた研究成果を社会に還元するように努めてきた。これまで、当該分野で顕著な成果を上げている海外の研究者と共に国際シンポジウムを開催することで、国際的にもこの分野を牽引する日本の非コードRNA研究を世界に向けて発信してきた。平成26年度の本研究取りまとめにおいては、過去の実績を踏まえ、本領域の研究期間である５年間を通して得られた研究成果を取りまとめ、その全体像を当該学問領域のみならず、一般国民に分かりやすく還元すると共に情報の発信を継続することを目的として下記の計画を遂行した。 ①本分野をリードする著名な海外の研究者を第37回日本分子生物学会年会シンポジウムおよびワークショップに招聘するとともに、本領域主催の「非コードRNA作用マシナリー」をテーマとした国際シンポジウムの開催し、領域の研究成果を国内外に発信すると共に海外の研究者との情報交換を強化した。②領域の研究成果を広く社会・国民に発信するためのアウトリーチ活動の一環として、領域班員がRNA関連研究を伝える活動を地域の教育・研究機関で行った。③領域の研究成果や上記イベント等を広報するために、引き続きncrna.jpドメインを維持し、ホームページやブログを継続公開・更新した。④研究成果をわかりやすくまとめた成果報告書を作成し、本領域外の科学分野面にも広く配布した。 以上のように、本領域の研究成果を当該分野のみならず、広く一般国民に還元することができたと考える。

クライオ電子顕微鏡法による異常終止コドン認識複合体の立体構造解析：H24年度は、これまでの分子機構研究の課程で明らかとした、「異常終止コドンを識別している分子複合体」の立体構造をクライオ電子顕微鏡法を用いて解析するため、動物細胞からのタンパク質複合体大量精製を行い、クライオ電子顕微鏡法により、複合体の分子構造を取得した。 a) クライオ電子顕微鏡法に用いるタンパク質複合体の精製：これまでの解析により、異常終止コドン識別複合体は、ribosome, eEF2, eRF1, eRF3, Upf1, SMG-1, SMG-8, SMG-9, Upf2, Upf3, エクソンジャンクション複合体、mRNAにより構成されていることを明らかにしている。H24年度は、SMG1C複合体(SMG1:SMG8:SMG9)、Upf1, Upf2, Upf1:Upf2複合体の精製を行った。これらを用いて、試験管内で、SMG1C:Upf1複合体, SMG1C:Upf2複合体, SMG1C:Upf1:Upf2複合体の再構成に成功した。さらに、共同研究によりクライオ電子顕微鏡法による立体構造の解析を行った。その結果、Upf1とUpf2はともに、SMG1の触媒領域付近に結合していることが明らかとなった。さらに、SMG1C:Upf1:Upf2複合体のクライオイメージ取得に成功し、解析を続けている。 b) 異常終止コドンを識別している分子複合体構成因子の分子間相互作用の解析: SMG1, Upf1, Upf2について、各種部位欠損変異体を作成し、精製した。これらを用いて分子間相互作用部位の同定をおこない、それぞれの結合部位を同定した。その結果、Upf1, Upf2はともにSMG1の触媒領域に結合した。これは、クライオイメージを元にした立体構造をサポートするものである。

上皮細胞を初めとする様々な細胞の極性制御の要として働いている普遍的な細胞極性シグナル経路、PAR-aPKC 系の新規構成員として ASPP2 を発見し、細胞極性の制御と細胞死の制御の間の関係を示唆した。PAR-aPKC 系の新たな制御機構として、aPKC 結合タンパク質 KIBRA が aPKCのキナーゼ活性を基質と競合的に抑制し Lgl とは異なる機構で aPKC を通じたアピカル膜ドメイン形成のプロセスを特異的に抑制することを見いだした。

VEGF,IL6,IL5,IFNbeta,IFNgamma遺伝子のノックイン用領域(終止コドン周辺2-2.5kbp)をクローニングした。さらに、IFNbeta遺伝子についてノックインベクターを構築した。続いて、数十kbpの遺伝子の導入が可能なFRT siteを1コピー持つHeLa TetOff, HeLaTetOnAdvanced, HCT116、N2A,MDCKII,BEAS-2B TetOff FRT細胞を作成した。また、BoxB配列を含む・含まないIL-6, IFNbeta,IL28B,IL-5遺伝子全体をpTRETight-FRTベクターに導入した。

mRNA監視機構(NMD)が疾患遺伝子の発現に影響する疾患の中には、NMD抑制で病態が回復するものがある。そのひとつウールリッヒ病患者繊維芽細胞をモデル細胞として、NMD抑制が細胞生理機能に及ぼす影響について検討した。NMD構成分子の発現を低下させたNMD抑制下では細胞周期への影響および小胞体ストレスの発生はなかったが、細胞増殖がSMG-8以外のNMD関連因子の発現低下で抑制された。また、化学物質曝露によるセレン欠乏下でセレン含有酸化還元系酵素がNMDにより障害され、酸化ストレスが生じることが明らかになった。

本研究により、動物細胞内からの高精度mRNP複合体精製システムを新たに構築することに成功した。具体的には、mRNP精製のためのタグであるBoxB配列を挿入したbeta-globin遺伝子由来のmRNA(翻訳型mRNA)とその5'非翻訳領域に翻訳開始を阻害する強固なステムループを形成する配列を挿入した遺伝子由来のmRNA(非翻訳型mRNA)をmRNP精製アフィニティータグを用いて精製した。mRNP精製アフィニティータグとして、BoxB結合ペプチドであるバクテリオファージNタンパク質(Nペプチド)にStreptavidin binding peptide(SBP)とGSTとFlag epitope tagを融合した物を使用した。この解析により、動物細胞内で翻訳中のリボソームが結合したmRNP(リボソーム、翻訳伸張因子を含む、スプライシング依存的mRNA結合タンパク質複合体であるEJCを含まない)と翻訳されていないmRNP(EJCをふくむ、リボソーム翻訳伸張因子を含まない)の構成因子が大きく異なることを生化学的に明らかとした。この結果は、動物細胞内で翻訳依存的にmRNPの大きな再構成が起こるということを初めて示した物である。

mRNA監視機構であるnonsense-mediated mRNA decay(NMD)の構成分子14個すなわちSMG-1、Upf1、p130、SURF complex(eRF1,eRF3a,eRF3b)、exon junction complex(Y14,MAGOH,eIF4A3,BtZ,RNPS1)、Upf2、SMG6、SMG7を標的にsiRNAを作成し、モデル細胞としたUllrich病患者繊維芽細胞に導入してNMDの抑制とその病態に及ぼす影響について検討した。モデル細胞では、collagen VI α2鎖のtriple helical domainをコードするexonにホモの欠失があり、フレームシフト変異によるPTC出現のためNMDが作動してcollagen VIα2 mRNAは分解される。導入した各々のsiRNAの細胞内発現によりNMDは抑制されたが、Upf1、SMG-1、p130、MAGOH、BtZ、SMG6、SMG7の7個の因子によるNMD抑制で、collagen VIα2 mRNA、細胞内collagen VIの発現が高いことが明らかになった。Upf1、SMG-1、p130、MAGOHのノックダウンでは、細胞外マトリックスにおけるcollagen VIの発現も高い傾向にあった。各因子のノックダウンが細胞生理機能に及ぼす影響について、細胞増殖、細胞周期、細胞ストレス応答への影響を検討したが、siRNA導入1週目までの短期的な影響はほとんど認められなかった。本研究により、NMD抑制による治療標的の最適な候補因子としてUpf1、SMG-1、p130、MAGOH、BtZ、SMG6、SMG7の7個のNMD componentが得られた。これらの因子の中期的、長期的なノックダウンが細胞生理機能に及ぼす影響についてはさらに検討する必要がある。