The 28,000-year-old remains of a woolly mammoth, named 'Yuka', were found in Siberian permafrost. Here we recovered the less-damaged nucleus-like structures from the remains and visualised their dynamics in living mouse oocytes after nuclear transfer. Proteomic analyses demonstrated the presence of nuclear components in the remains. Nucleus-like structures found in the tissue homogenate were histone- and lamin-positive by immunostaining. In the reconstructed oocytes, the mammoth nuclei showed the spindle assembly, histone incorporation and partial nuclear formation; however, the full activation of nuclei for cleavage was not confirmed. DNA damage levels, which varied among the nuclei, were comparable to those of frozen-thawed mouse sperm and were reduced in some reconstructed oocytes. Our work provides a platform to evaluate the biological activities of nuclei in extinct animal species.

INTRODUCTION: Bivalve molluscs have flourished in marine environments, and many species constitute important aquatic resources. Recently, whole genome sequences from two bivalves, the pearl oyster, Pinctada fucata, and the Pacific oyster, Crassostrea gigas, have been decoded, making it possible to compare genomic sequences among molluscs, and to explore general and lineage-specific genetic features and trends in bivalves. In order to improve the quality of sequence data for these purposes, we have updated the entire P. fucata genome assembly. RESULTS: We present a new genome assembly of the pearl oyster, Pinctada fucata (version 2.0). To update the assembly, we conducted additional sequencing, obtaining accumulated sequence data amounting to 193× the P. fucata genome. Sequence redundancy in contigs that was caused by heterozygosity was removed in silico, which significantly improved subsequent scaffolding. Gene model version 2.0 was generated with the aid of manual gene annotations supplied by the P. fucata research community. Comparison of mollusc and other bilaterian genomes shows that gene arrangements of Hox, ParaHox, and Wnt clusters in the P. fucata genome are similar to those of other molluscs. Like the Pacific oyster, P. fucata possesses many genes involved in environmental responses and in immune defense. Phylogenetic analyses of heat shock protein70 and C1q domain-containing protein families indicate that extensive expansion of genes occurred independently in each lineage. Several gene duplication events prior to the split between the pearl oyster and the Pacific oyster are also evident. In addition, a number of tandem duplications of genes that encode shell matrix proteins are also well characterized in the P. fucata genome. CONCLUSIONS: Both the Pinctada and Crassostrea lineages have expanded specific gene families in a lineage-specific manner. Frequent duplication of genes responsible for shell formation in the P. fucata genome explains the diversity of mollusc shell structures. These duplications reveal dynamic genome evolution to forge the complex physiology that enables bivalves to employ a sessile lifestyle in the intertidal zone.

[Abstract] In metazoans, carbonic anhydrase（CA）is a common enzyme that catalyzes the reversible hydration of carbon dioxide. CA plays important roles in many biological processes, and in molluscs several CA-like proteins are thought to be responsible for calcification in shell formation. As part of our investigation of the process of shell formation, we searched for a CA gene in the oyster Crassostrea gigas, with resultant identification of a single cDNA that encodes two CA domains. This atypical CA is similar to an α-CA and is mainly expressed in the egg. This suggests that the newly identified CA is responsible for production of bicarbonate in the early development phase prior to metamorphosis. [要旨] 炭酸脱水酵素は後生動物に広く存在しており、二酸化炭素の水和を可逆的に触媒する。機能的には様々な生命過程で重要な役割を担っており、軟体動物では炭酸脱水酵素や類似タンパク質が貝殻形成における石灰化に関与していることが示唆されている。本論文では、貝殻形成の過程を調べる研究の中で同定したマガキの新規炭酸脱水酵素について報告する。単離したcDNA は、二つのCA ドメインを有しており、典型的な炭酸脱水酵素とは構造が異なっていたが、それぞれのCA ドメインはα タイプの炭酸脱水酵素との類似性を示した。また、今回同定した新規炭酸脱水酵素は卵での発現が著しく高く、変態前の重炭酸イオンの生成を担っていると推察される。

Departmental Bulletin Paper

マガキCrassostrea gigasの40Sリボソームタンパク質S5, S18, S27, S30に関して、cDNAを単離し塩基配列を決定した。予想されるアミノ酸配列は、いずれもCrassostrea virginica種において明らかにされている配列と高い相同性を示した。S30は、ユビキチン様ドメインと融合遺伝子として転写されており、Crassostrea gigasとCrassostrea virginicaにおいてひとつの転写ユニットであるにもかかわらず、ユビキチン様ドメインとS30領域では、相同性において明らかな違いがみられ、モザイク的な進化が生じた考えられる。発現様式は、それぞれのサブユニットごとに違いがみられ、S27では、閉殻筋での強い発現が認められた。

マガキリボソームタンパク質遺伝子の構造解析

マガキチューブリン遺伝子の構造解析

継続後誌:近畿大学先端技術総合研究所紀要= Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University

In this communication, we analyzed primarily an O157 strain isolated during the EHEC outbreak in Tokyo and revealed that all stx-converting phages examined were lambdoid and induced with ultraviolet light or norfloxacin and that an optimal dosage required for induction and patterns of time course in VT-specific DNA synthesis and toxin release were essentially similar to those in an O157 Sakai strain as described in the previous report. But the relationship appears to be rather remote between stx-converting phages lysogenized in O157 strains prevalent in Sakai city, west of Japan and those in O157 strains prevalent in Tokyo and Nagano, east of Japan in 1996, since the immunity is different from each other. Thus, stx-converting phages derived from the same hosts or the same prevalent area are related to each other but lower degree of relatedness is observed for those derived from different years and areas. These results may be accounted for by a hypothesis of the presence of a cassette of lysis genes associated with an stx gene that is mutually exchangeable by recombination between these phages.継続後誌:近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University

継続後誌:近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University貝殻は無脊椎動物における典型的な硬組織であり、方解石あるいはアラレ石構造の炭酸カルシウムの結晶からなる。アコヤ貝の硬組織についてみると、外側は稜中層と呼ばれ、方解石構造の炭酸カルシム結晶であり、また、真珠層と呼ばれる内側は同様に炭酸カルシムの結晶であるが、アラレ石構造である。これらの硬組織形成には以前から炭酸脱水酵素が関与することが指摘されてきたが、アコヤ貝稜中層よりEDTAで抽出した可溶性マトリックスタンパク質中にも真珠層と同様に炭酸脱水酵素の存在が確認された。この酵素は稜中層における方解石構造形成過程で働くものと思われ、真珠層のナクレインに対応するものと考えられる。また、一般的に、炭酸脱水酵素は硫化ナトリウムやスルファニルアミドで活性が阻害されるが、可溶性マトリックス中の酵素は硫化ナトリウムに抵抗性であることが解かった。 （英文） Mollusk shells are typical hard tissue in invertebrate, and composed of either calcite or aragonite, differ with polymorphs of CaCO_3. Shell of pearl oysters (Pinctada fucata) consists of both layers, one is outer prismatic layer which is bearing calcite, another is inner nacreous layer which is bearing aragonite. It is already suggested that carbonic anhydrases that catalyze the interconversion of CO_2 and H_2O (CO_ 2 ＋ H_2O ⇔ HCO_3^－ ＋ H^＋) are participate in the process of calcification. We have detected a carbonic anhydrase activity in the soluble matrix proteins from the prismatic layer in Pinctada fucata. A putative molecular weight is about 60KDa. It is assumed that this enzyme is responsible for the formation of prismatic layer and corresponds to nacrein in the nacreous layer. Sulfanilamide and sodium sulfate are generally inhibitors of carbonic anhydrases. However, these enzymes in the soluble matrix proteins are resistance to sodium sulfate.

継続後誌:近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University微小ガラス針を使って受精卵前核に遺伝子溶液を注入する顕微注入法に代わる簡便なトランスジェニックマウスの作製方法を検討するために、外来遺伝子を雄マウスの精巣に直接注入して雌マウスと交配させることによって、トランスジェニックマウスを作製することを検討した。DNA/リポソーム複合体を4匹の雄マウスの精巣に直接注入したのち静置させ、1週間後に雌マウスと交配させたところ、計38匹の産子を獲得した。離乳後各マウスの尾部組織より抽出したゲノムDNAを使ったサザンプロット解析の結果、5匹のマウスに導入遺伝子の組込みが認められた。そのうち、次世代へ導入遺伝子の伝達が認められたトランスジェニックマウスは、2匹であった。また、トランスジェニックマウスのゲノムDNAから導入遺伝子と考えられる遺伝子断片の一部を増幅し、ダイレクトシークエンスでその塩基配列を決定したところ、導入遺伝子がマウス染色体へ組込まれていることが確認された。以上の結果より、経精巣遺伝子導入法によるトランスジェニックマウスの作製の可能性が示唆された。しかし、精巣に導入されたDNAと精子の結合様式、また卵子と受精後の染色体への組込み機序については未だ不明な点が多く、今後さらに検討が必要と考えられた。 （英文） DNA transfer mediated by sperm has the potential to simplify the production of transgenic animals, but the possibility in mice has been controversial. On the other hand, the ability of animal spermatozoa to capture foreign DNA has been suggested. In this study, we investigated the feasibility to produce transgenic mice by direct injection of foreign DNA in mouse testis. DNA/liposome complex was injected through a needle into testes bilateral testis of four mature mice. After all males were mated with female mice, 38 pups were delivered. In Southern blot analysis and direct sequencing, the foreign DNA was shown to be integrated in host genome of five mice (13％). However, only two trangenic mice exhibited the transmission of transgene to next generation. Thus, direct introduction of exogenous DNA/liposome complex into the testis will provide a simple methodin generation of transgenic mice, and further investigations are also necessary to determine molecular mechanisms based on the uptake of foreign DNA by sperm.

軟体動物による結晶形成は、一般的に酸性の高分子によって制御されている。本研究では、真珠貝の真珠層から主要なタンパク質であるnacreinタンパク質を同定し、そのcDNAをクローニングすることに成功した。単離したcDNAから予想されるポリペプチドはカーボニックアンヒドラーゼと相同なドメインとカルシウム結合ドメインと思われる領域を有していた。このことは、nacreinが構造タンパク質であると同時に酵素タンパク質としても機能していることを示唆する。また、nacrein存在下においてin vitroでのアラレ石結晶の形成が観察されたことから、nacreinは結晶化の開始と結晶型の決定において重要な役割を担っていると推察される。

軟体動物による結晶形成は、一般的に酸性の高分子によって制御されている。本研究では、真珠貝の真珠層から主要なタンパク質であるnacreinタンパク質を同定し、そのcDNAをクローニングすることに成功した。単離したcDNAから予想されるポリペプチドはカーボニックアンヒドラーゼと相同なドメインとカルシウム結合ドメインと思われる領域を有していた。このことは、nacreinが構造タンパク質であると同時に酵素タンパク質としても機能していることを示唆する。また、nacrein存在下においてin vitroでのアラレ石結晶の形成が観察されたことから、nacreinは結晶化の開始と結晶型の決定において重要な役割を担っていると推察される。

Nacreinタンパク質が炭酸カルシウム結晶形成に与える影響を調べた。

アコヤガイ外套膜で発現する遺伝子を報告した。

軟体動物の外套膜で発現する細胞骨格様の遺伝子のいくつかに関してcDNAを単離し、その塩基配列を決定した。

アコヤガイnacrein遺伝子の機能解析を行った。

マガキの卵特異的に発現する新規炭酸脱水酵素様遺伝子の塩基配列を報告した。

アコヤガイ外套膜で発現する遺伝子のEST解析に関して報告した。

マガキグリシンリッチタンパク質の一次構造と組換えタンパク質の機能を調べた。

アコヤガイに存在するnacrein遺伝子の炭酸カルシウム結晶形成に与える影響を検討した。

軟体動物における炭酸脱水酵素遺伝子の構造と機能の特性に関して報告した。

マガキ外套膜で発現する新規グリシンリッチタンパク質の炭酸カルシウム形成に与える影響を検討した。

日本産およびアメリカ産カキのリボソームタンパク質遺伝子の比較を行った。

軟体動物に存在する炭酸脱水酵素様遺伝子の塩基配列を報告した。

軟体動物に存在する炭酸脱水酵素用遺伝子に関して報告した。

マガキの新規炭酸脱水酵素様遺伝子の構造解析に関して報告した。

マガキの新規グリシンリッチタンパク質に関して報告した。

マガキで同定された新規炭酸脱水酵素に関して報告した。

軟体動物であるマガキを材料として、外套膜で発現する新規グリシンリッチタンパク質の構造と機能に関して報告した。

軟体動物の新しい炭酸脱水酵素の遺伝子クローニングに関して報告した。

真珠養殖の過程と真珠層形成に関与する遺伝子nacreinについて紹介した。

無脊椎動物の骨格として典型的な貝殻は、種を同定するための重要な指標とされることからも明らかなように、生物がつくりだす遺伝的に規定された構造物である。ところが、この貝殻、生物によってつくり出されることは間違いないのだが、生物的でない特徴を有している。軟体動物の外套膜と呼ばれる組織の働きにより形成されるのにもかかわらず、その成分の大部分を無機物である炭酸カルシウムが占めているのである。したがって、貝殻の成長は、炭酸カルシウム結晶の無機的なエピタキシャル成長に依っている部分があると考えられるが、当然のことながら、それだけでは貝殻の種特異的な形成を説明することはできない。何か生物的な要素が絡んでいると考えられる。そこで、注目すべきは、貝殻の中に含まれるタンパク質成分であり、これらのタンパク質は外套膜から分泌されることが分かっている。本研究は、以上の観点より、外套膜で発現する遺伝子を解析することにより貝殻形成の分子機構の全体像に迫ることを目的としており、カキおよびアコヤガイの外套膜で発現する遺伝子の解析を行った。当該成果は以下の4つにまとめられる。 1.カキ外套膜で発現するハウスキーピング遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。 2.カキ外套膜で発現する新規グリシンリッチタンパク質をコードする遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。また、組換えタンパク質を精製後、Calcium carbonate precipitation assayにより、炭酸カルシウム結晶形成に対して抑制的な働きをもつことを示した。 3.アコヤガイ真珠層に存在するナクレイン遺伝子に関して、炭酸カルシウム結晶形成に対して抑制的な働きをもつことを示した。さらに、必要ドメインを特定した。 4.アコヤガイ外套膜で発現する新規グリシンリッチタンパク質をコードする遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。

腸管出血性大腸菌O157感染症は、一頃のように大流行を見せることはなくなってきた。しかしながら、先進国において散発的に感染者が観察されており、その効果的な治療法の確立が待望されている。O157感染では溶血性尿毒症などの重篤な症状が小児において著しく、治療は困難をきわめている。溶血性尿毒症の原因はO157が産するベロ毒素が原因となっていると考えられており、その遺伝子はO157に溶原化するラムダ様ファージゲノム中に存在している。ベロ毒素遺伝子は2種類に大きく分類され、stx1,stx2と表記される。この二つの遺伝子のどちらを有するかにより、溶原ファージの種類が分けられ、それぞれVT1ファージ、VT2ファージと呼ばれる。 先に私たちの研究グループではO157に内在するVT2ファージの全ゲノム構造を明らかにし、それが、基本的にラムダと同一であることを示した。本研究ではstx2遺伝子の発現機構を明らかにするために、stx2の上流にあるpR'プロモーターの同定を行った。方法としてはpR'プロモーターと思われる領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドを大腸菌BL21株に導入し、ルシフェラーゼの酵素活性を指標として、pR'プロモーターの絞り込みを行った。その結果、Q遺伝子の3'端180塩基では非常に高いルシフェラーゼ活性を確認することができたが、Q遺伝子の3'端180塩基にそのさらに下流320塩基を加えた配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだ場合には活性が低下した。このことはQ遺伝子の3'端180塩基にプロモーターが存在し、その下流320塩基にはターミネーターが存在することを意味する。

腸管出血性大腸菌0157感染症は、アメリカおよび、日本の大阪府堺市におけるように先進国において爆発的な流行を見せる場合がある。その症状の重篤性は特に小児おいて著しく、溶血性尿毒症症候群を引き起こすことがしられている。溶血性尿毒症症候群の治療は困難で、その発症を防ぐ手だてこうずることが必要である。そのためには、溶血性尿毒症症候群の原因とされるベロ毒素生産機構を解明する必要がある。ベロ毒素遺伝子はO157溶原化するラムダ様ファージにコードされており、本研究により私たちは、このラムダ様ファージの一つであるVT2ファージの全ゲノム構造を明らかにした。その結果、VT2ファージの基本的なゲノム構造はラムダファージと極めて類似していることが判明した。ベロ毒素遺伝子は後期転写遺伝子群に属し、ファージの増殖とリンクした形でベロ毒素遺伝子は転写されると思われる。 本研究では、stx2遺伝子の発現機構を明らかにするために、stx2の上流にあるpR'プロモーターの同定を行つた。その結果、Q遺伝子の3'端18O塩基では非常に高いルシフェラーゼ活性を確認することができたが、Q遺伝子の3'端180塩基にそのさらに下流320塩基を加えた配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだ場合には活性が低下した。このことはQ遺伝子の3'端180塩基にプロモーターが存在し、その下流320塩基にはターミネ-タ-が存在することを意味する。ターミネターに関しては、in vitro転写により、その存在が同様の位置に確認された

アコヤガイの貝殻は炭酸カルシウムの結晶と微量の有機成分から構成されている。有機成分としてはタンパク質が主なものであり、タンパク質によって炭酸カルシウムの結晶形成が制御されることが報告されている。貝類の炭酸カルシウム結晶としては真珠層のアラレ石と稜中層の方解石があり、それぞれ特異的なタンパク質によって誘導されると推察されている。真珠層タンパク質としてはすでにNacreinタンパク質の遺伝子に関して報告しているが、本研究では真珠層に存在する新しいタンパク質として新たにPearlinを単離し、そのcDNAをクローニングすることに成功した。cDNAから予想されるPearlinタンパグ質は131アミノ酸残基よりなり分子量は16000であった。既知のタンパク質との相同性はみられなかったが、アスパラギン酸が多く含まれており、酸性タンパク質として炭酸カルシウムの結晶形成に関与していると推察される。このタンパク質を基盤として、飽和炭酸カルシウム中で結晶形成を誘導し、そのX線回折を行ったところ、アラレ石特有のピークが観察された。このことから、Pearlinタンパク質はアコヤガイ真珠層においてアラレ石結晶の形成を誘導していると考えられる。

貝殻などのバイオミネラル形成が、遺伝的に制御された過程であることは明らかであり、貝殻中に含まれるタンパク質が炭酸カルシウムの結晶形成を左右することが報告されている。この報告を受け、最近のバイオミネラリゼーション研究の流れは、個々のタンパク質を同定し、その一次構造を決定することに主眼がおかれてきた。しかし、これらのタンパク質の特珠性ゆえか、現在までに同定されているタンパク質は数えるほどしかない。我々のグループでは、アコヤガイを材料として、バイオミネラル中に存在するタンパク質であるnacreinのcDNA単離に成功し、貝殻形成を左右するタンパク質解析への口火をきった。 本年度の本研究では、nacreinタンパク質がアコヤガイのような二枚貝だけではなく、ヤコウガイのような巻き貝にも存在し、グリシン、アスパラギンの繰り返し配列の特徴に両者の間で違いのあることを示した。また、nacreinタンパク貿が真珠層のアラレ石形成を制御していることを明らかにした。

ゲノムインプリンティング(遺伝的刷り込み)遺伝子の一つであるmammalian acheate-scute homologue 2(Mash2)は、胎盤形成で重要な栄養外胚葉系列の発生に重要な役割を果たす最初の転写因子ではないかと考えられている(Guillmot et al.,Nature 371:333,1994)。そこで、胎児の成長を促進する遺伝子が発現しているが胎盤形成が不完全なため発生途中で胚死する雄性発生胚に、胎盤形成に重要である Mash-2 あるいはその近傍の H19を導入して強制発現させることによって、雄性発生胚を個体まで発生させることを目的に研究を進めた。その結果、内在性Mash2遺伝子発現を抑制するようにアンチセンス遺伝子を導入した実験においても、過剰発現させるような導入遺伝子を構築し導入した実験においてもトランスジェニックマウス個体を得ることはできなかった。このことから、Mash2遺伝子は胎盤形成時期においても重要な役割を果たしていることが示された。また、ウサギMash2cDNAのクローニングを試みたところ、ウサギのホモログは得られなかったものの、哺乳類全般の胎盤形成を伴う初期胚発生の過程で重要な役割を担っていると推察される新規の遺伝子がクローニングされた。今後、この遺伝子の機能解析を行って、Mash2遺伝子との関連を調べるとともに、ゲノムインプリンティングの面からも検討していく予定である。